本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体公开一种沙冬青Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白，来源于沙冬青（Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ），名称为ＡｍＮＨＸ１，其氨基酸序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：２所示。沙冬青Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一：１）序列表中的ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：１；２）编码序列表中ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：２氨基酸序列的多核苷酸。本发明专利技术的基因将在沙冬青耐盐耐旱分子机制研究及植物耐盐耐旱性状改良中发挥重要作用。
Transporter for regulating salt tolerance and drought resistance of plant and its coding gene and Application
The invention belongs to the technical field of plant gene engineering, in particular discloses a Ammopiptanthusmongolicus Na + / H + antiporter protein encoding gene and application thereof. Na + / H + antiporter provided by the invention, from Ammopiptanthusmongolicus (Ammopiptanthusmongolicus), named AmNHX1, its sequence of amino acids such as SEQ? ID? As shown in NO:2. The coding gene for Na + / H + reverse transporter is one of the following nucleotide sequences: 1) SEQ in the sequence table ID? NO:1 (2) SEQ in a coded sequence table? ID? NO:2 amino acid sequence polynucleotide. The gene of the invention will play an important role in the study of the molecular mechanism of salt tolerance and drought tolerance and the improvement of salt tolerance and drought tolerance in plants.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种转运蛋白及其编码基因与应 用，特别是涉及沙冬青的Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
盐害和干旱是限制农作物生长的两大限制因子。中国的干旱区面积占全国总面积 的1/3，盐碱土广泛分布于其中，干旱与盐渍并存严重限制了我国农作物产量的提高和农业 发展。因此，了解和研究植物耐盐碱抗干旱胁迫的机制；从我国特有的资源生物中克隆抗盐 耐干旱基因，获得宝贵的基因资源；培育耐干旱耐盐碱农作物具有重要的现实和战略意义。 植物在长期进化过程中，形成了一系列抵抗干旱和盐渍胁迫的适应机制。如在细 胞中积累无害的可溶性小分子物质；通过Na+外排途径将Na+排出细胞以及提高下游抵抗 氧化伤害的抗氧化酶的活性等等。其中通过Na+/H+反向转运蛋白在液泡中积累Na+ —方 面可以降低Na+在细胞质的含量，降低Na+的毒害性；另一方面还可以降低细胞水势，能够 让植物在高盐溶液中获得和保持更多的水分(Cixin He等，Plant Cell Physiol. 46 (11): 1848-1854(2005))。 NHX基因家族是植物中Na+区隔化至液泡的关键基因，自1985年Blumwald 和Poole首先在甜菜根部贮藏组织的液泡膜上发现Na7H+逆向转运活性以来，人 们相继发现在盐生植物，如滨藜(Atriplex gmelini)，兼性CAM植物冰叶日中花 (Messembryanthem獄rystalli皿m)、甜菜(Red beet)等禾口甜土植物，如大麦、车前 (Plantago maritima)、长春花、棉花、水稻、向日葵等的液泡膜上普遍存在着Na+/H+逆向转 运活性，并且克隆到了它们的Na7H+反向转运蛋白编码基因(安静，张荃，生命科学，第18 巻第3期，2006年6月)。AtNHXl的结构功能已研究得较为详细。目前，研究人员已经对 AtNHXl进行了亚细胞定位、蛋白活性测定、插入突变、酵母突变体的功能互补以及过量表达 等多方面的研究。AtNHXl对于植物的耐盐性、体内离子动态平衡以及整个的植物发育过程， 都起到非常重要的作用(安静，张荃，生命科学，第18巻第3期，2006年6月)。 AtNHXl是迄今为止，单个基因改良植物耐盐性状最有效的基因之一。在拟南芥，番 茄，油菜，水稻，小麦，黑麦草，高羊茅，棉花，烟草等植物中过量表达拟南芥AtNHXl基因均 能够有效提高植物耐盐性能。最近Brini和Moez Hanin等在拟南芥中过量表达小麦TNHX1 发现不仅能够显著提高转基因植株的耐盐性而且能够显著提高转基因植株的耐干旱性状。 (Journal of Experimental Botany, Vol. 58， No.2， pp. 301-308，2007)。 沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus (Maximl) Cheng Fl)又名蒙古沙冬青、蒙古 黄花木，是古老的第三纪残遗种，也是迄今为止我国温带荒漠的惟一珍贵常绿灌木，是阿拉 善荒漠区所特有的建群植物(郭生祥，甘肃林业科技，第30巻第4期，2005年12月)。沙 冬青不仅具有极强的抗干旱性，抗高温，耐低温以及抗风蚀沙埋还具有很强的抗盐性，种子 能够在含有200mm NaCL的MS培养平板上正常生长。目前对沙冬青的耐逆性研究仅停留在生理生化阶段，从遗传上阐述沙冬青的抗逆性机制是一片空白。因此借助拟南芥模式生物， 挖掘沙冬青重要的抗逆性基因资源，并应用到农作物抗逆性状改良上具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种沙冬青Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因，以及该基因 在调控植物耐盐和抗寒性方面的应用。 本专利技术所提供的沙冬青Na7H+逆向转运蛋白，是具有SEQ ID NO. 2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将该序列的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与该序列的氨基酸残基序列相同活性的由该序列衍生的蛋白质。记为AmNHXl。 沙冬青Na7H+逆向转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸之一 l)SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。 2)编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多核苷酸。 序列表中SEQ ID NO. 1由1986个碱基组成，该基因的读码框为自5'端第80位至 1711位碱基；序列表中SEQ ID NO. 2由553个氨基酸残基组成。 本专利技术还包括含有本专利技术基因的表达载体和细胞系。本专利技术的基因可用于沙冬青 耐盐耐旱分子机制研究，并且本专利技术基因可用于植物耐盐和耐旱性状改良。附图说明 图1为AmNHXl中间片断扩增产物凝胶电泳图谱。 图2为AmNHX13'端扩增产物凝胶电泳图谱。 图3为AmNHX15'端扩增产物凝胶电泳图谱。 图4为沙冬青Na+/H+逆向转运蛋白系统发生树。 图5为沙冬青Na+/H+逆向转运蛋白疏水性分析。 图6为沙冬青Na+/H+逆向转运蛋白与其他植物Na+/H+逆向转运蛋白同源性分析。 图7为盐胁迫下野生型拟南芥和转基因植株表型。 图8为干旱胁迫十六天野生型拟南芥和转基因植株表型(A)和回复浇水16小时 之后野生型拟南芥和转基因植株表型(B)。具体实施例方式实施例1、沙冬青Na+/H+逆向转运蛋白编码基因的获得 1. 1沙冬青盐胁迫处理 沙冬青种子用0. 01 % HgC12表面灭菌15分钟，无菌水冲洗5次，37。C无菌水浸泡 过夜后移至1/2MS+1. 5%蔗糖+1. 0%琼脂+200mmNaCl盐胁迫培养基上。在16h L/8h D光 照，24t:条件下培养一周. 1.2RNA提取 取经过盐胁迫处理的沙冬青幼根材料约0. lg。液氮充分研磨后，转移到1. 5ml离 心管，加lml TRlzol (invitrogen公司)，混匀后，室温放置15分钟，加0. 2ml氯仿:异戊 醇(24 : 1)，剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm， 4t:离心15分钟。取上清液并加 入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm，4t:离心15分钟。70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经0. 1 % DEPC处理过的ddH20水中，贮存于-80°C 备用。 1. 3cDNA第一链合成和反转录PCR 采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操 作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为2ug制备的总RNA，O. 5ul Rnaseinhibitor，加DEPC处理过的去离子水至8. 5ul，2ul的Oligo(dT) 18primer. 65°C， 5min，室温放置10min，13000rpm简短离心5s。再依次力Q入4 ii 1 5XFirst-Strand buffer, 0. 5 ii 1 RNase Inhibitor, 2 ii 1 lOOmM DTT，2yl dNTP， 1 ii 1 MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37。C反转录1小时，90。C 5分钟；冰上冷却；13000rpm短暂离心 5秒钟，存放于_201:待用 1. 4RT-PCR扩增AmNHXl基因中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种沙冬青Ｎａ↑［＋］／Ｈ↑［＋］逆向转运蛋白，其特征在于是具有ＳＥＱＩＤＮＯ．２所示氨基酸残基序列的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒯本科，魏强，郭玉娟，孙镇菲，梁宁菁，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。