【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体而言，涉及一种抗柑橘黄龙病的非典型mekk蛋白csmekk1-1及抗病柑橘制备方法。
技术介绍
1、柑橘是我国最重要的果树树种之一。然而，随着柑橘产业的发展，柑橘黄龙病(citrus huanglongbing,hlb)已成为危害柑橘产业发展最严重的病害，黄龙病病原菌为韧皮部杆菌属(candidatus liberibacter)细菌，包括亚洲种(candidatus liberibacterasiatium，calas)、非洲种(candidatus liberibacter africanum，calaf)和美洲种(candidatus liberibacter americanus，calam)，其中calas是世界范围柑橘产区的主要致病种，几乎危害所有柑橘品种。
2、因此开展黄龙病防控技术和抗病育种的研究时非常必要的。然而，由于柑橘遗传背景高度杂合，再加上(1)calas为难培养细菌，迄今无法人工分离培养；(2)木虱或接穗嫁接传毒方法无法控制病原菌的含量和纯度，且潜育期和发病周期长，接种成功率低；(3)病原菌在植株体内分布极不均匀，且受到其它植原体的影响。这些因素严重制约了人们对柑橘黄龙病与寄主互作分子机制的研究，也是目前黄龙病抗性育种几乎毫无进展的一个主要原因。
3、随着分子生物学技术的发展，利用基因工程技术，将外源基因导入柑橘体内，增强植株抗病性，是目前较为流行的方法。比如，dutt等在易感品种甜橙中超量表达拟南芥atnpr1，组成型激活sa信号传导，激活病程相关
4、为了应对病原菌的入侵，植物进化出了多种抗病途径，比如病原物相关分子模式(pamps，pathogen-associated molecular patterns)触发的免疫反应(pamps-triggeredimmunity，pti)和效应子触发的免疫反应(effector-triggered immunity，eti)。pti是植物免疫的第一道防线，这一过程需要植物的模式识别受体(prr)。prr识别微生物分泌的pamps，并通过丝裂原活化蛋白激酶(mapk)信号的级联反应，将胞外信号传入核内，最终调控下游防御基因表达。mapk级联途径主要由mp3k(丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶)、mp2k(丝裂原活化蛋白激酶激酶)、mapk(丝裂原活化蛋白激酶)3种激酶组成。当质膜上的受体受到外界刺激后激活mp3k，mp3k的初始活化可以激活下游mp2k的磷酸化，进而激活mapk，最终调控下游相关基因的表达。已有研究发现，植物mapk级联反应在拟南芥、烟草、水稻、番茄对病原菌的防御反应中扮演着重要角色，比如鞭毛蛋白flg22能够快速强烈激活拟南芥mapk3/mapk、mapk4/mapk和mapk6/mapk，从而诱导病程相关(pr)蛋白的表达；超量表达拟南芥mkk2/map2k的转基因植株降低了内源sa的含量，表现出对pstdc3000和胡萝卜软腐欧氏杆菌的抗性。
5、mapk信号途径能够将外界的信号逐级放大并传递至细胞核中，而mekk1作为拟南芥中最早表征的map3ks之一，能够被很多的外界信号激活并将信号传递下去，比如，mekk1的活化与植物的生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等各种响应相关联。研究报道，flg22是细菌鞭毛蛋白中的一个保守的小肽，通过识别prr蛋白fls2及其共受体bak1引发植物中的先天免疫反应，包括胼胝质沉积、活性氧爆发、pr基因表达和幼苗生长抑制等诱导发病机制相关的免疫反应。asai等开发了一种基于细菌鞭毛蛋白flg22诱导早期防御基因转录的拟南芥叶细胞系统，使用原生质体瞬时表达系统实验鉴定了完整的mapk级联(mekk1-mkk4/mkk5-mpk3/mpk6)和wrky22/wrky29转录因子，它们在鞭毛蛋白受体fls2的下游发挥作用。ichimura等的研究发现拟南芥体内还存在另一条mapk级联通路：mekk1-mkk1/2-mpk4，mpk4的下游底物是mks1和转录因子wrky33。综上所述，拟南芥受到flg22刺激后会产生2条平行的信号通路：flg22-fls2/bak1-mekk1-mkk4/5-mpk3/mpk6-wrky22/wrky29和flg22-fls2/bak1-mekk1-mkk1/2-mpk4-mks1/wrky33信号通路，前者是mpk3/6介导的正调控机制，后者是mpk4介导的负调控机制。nakagami等研究发现mekk1激酶活性和蛋白质稳定性受h2o2以蛋白酶体依赖性方式调节，mekk1植物在ros诱导的mpk4激活中受到损伤，证明mekk1-mpk4信号途径是ros代谢过程中必不可少的组分。由此可见，mekk1可能是病原菌相关基因，参与了植物抵御病原侵害的过程。利用mekk1基因进行抗病分子育种具有重大的潜力。
6、mapkkk是mapk级联中家族成员最多、功能最复杂的组分。拟南芥mapkkk基因家族包括80多个成员，基于蛋白激酶催化结构域氨基酸序列的关系，被分为3个亚家族：mekk亚族、zik亚族和raf亚族，包括21个mekk1，48个raf和11个zik(ichimura et al.,2002)。mekk亚族激酶的保守催化结构域是g(t/s)px(w/y/f)mapev，zik亚族激酶的保守催化结构域是gtpefmape(l/v)y，raf亚族激酶的保守催化结构域是gtxx(w/y)mape。目前研究最广泛的mekk1和yda属于mekk亚族，而edr1(enhanced disease resistance 1)和ctr1(constitutive triple response 1)属于raf亚族。除此之外，有一类mapkkk只含mapkkk家族蛋白激酶功能结构域pkc和保守的gxgxxgxv模块，但不含有mekk蛋白的特征型g(t/s)px(w/y/f)mapev结构域，属于非典型的mekk亚家族，目前，尚没有利用这类非典型mekk提高柑橘对黄龙病的抗性的研究和应用。
7、有鉴于此，特提出本申请。
技术实现思路
1、本专利技术为提高柑橘对黄龙病的抗性，提供一种抗柑橘黄龙病的非典型mekk蛋白csmekk1-1及抗病柑橘制备方法，通过将柑橘丝裂原活化蛋白激酶csmekk1-1基因过表达载体整合到柑橘中，促进柑橘积累csmekk1-1蛋白，能够显著提高柑橘对黄龙病的抗性，并且不影响转基因植株的表型，在柑橘抗黄龙病育种中具有重大的应用价值，可以作为候选基因同多个黄龙病抗、感病基因进行黄龙病抗性育种。
2、本专利技术通过下述技术方案实现：
3、第一方面，本专利技术提供一种抗柑橘黄龙病的非典型mekk蛋白csmekk1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1，其特征在于，所述CsMEKK1-1蛋白为MAPK级联反应中第一级联的蛋白磷酸激酶，不含有MEKK蛋白的特征型G(T/S)Px(W/Y/F)MAPEV结构域，只含MAPKKK家族蛋白激酶功能结构域PKc和保守的GxGxxGxV模块，所述CsMEKK1-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过调节柑橘属植物中CsMEKK1-1蛋白的表达水平，提高柑橘属植物对柑橘黄龙病的抗性。
2.根据权利要求1所述的抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1，其特征在于，编码CsMEKK1-1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1，其特征在于，调节CsMEKK1-1蛋白表达水平的具体方法为：上调柑橘属植物中CsMEKK1-1蛋白的表达水平，激活MAPK信号通路。
4.根据权利要求3所述的抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1及抗病柑橘制备方法，其特征在于，上调柑橘属植物中CsMEKK1-1蛋
5.一种具有抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1的抗病柑橘制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的具有抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1的抗病柑橘制备方法，其特征在于，步骤(1)中，柑橘CsMEKK1-1基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增CsMEKK1-1基因编码序列DNA片段。
7.根据权利要求6所述的具有抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1的抗病柑橘制备方法，其特征在于，步骤(1)中，克隆柑橘CsMEKK1-1基因编码序列所采用的PCR引物为OE-F和OE-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示。
8.根据权利要求5所述的具有抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1的抗病柑橘制备方法，其特征在于，步骤(2)中，过表达载体构建方法为：以pNmGFPer为载体，pNmGFPer载体带有CaMV 35S启动子，CaMV 35S启动子为花菜花叶病毒启动子，具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，利用SalⅠ和BamHⅠ酶切目的片段后连接到SalⅠ和BamHⅠ酶切回收的载体上，构建过表达载体pNmGFPer-CsMEKK1-1。
9.根据权利要求5所述的具有抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1的抗病柑橘制备方法，其特征在于，步骤(3)中，过表达载体转化柑橘的方法为：过表达载体通过热激法转化根癌农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、GFP荧光鉴定、嫁接后得到转基因植株。
10.根据权利要求5所述的具有抗柑橘黄龙病的非典型MEKK蛋白CsMEKK1-1的抗病柑橘制备方法，其特征在于，还包括通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-F和ID-R，ID-F是取自pNmGFPer载体上CaMV 35S的一段序列，ID-R是根据CsMEKK1-1基因末端序列设计，引物如SEQ ID No：6和SEQ ID No：7所示核苷酸序列；
...【技术特征摘要】
1.一种抗柑橘黄龙病的非典型mekk蛋白csmekk1-1，其特征在于，所述csmekk1-1蛋白为mapk级联反应中第一级联的蛋白磷酸激酶，不含有mekk蛋白的特征型g(t/s)px(w/y/f)mapev结构域，只含mapkkk家族蛋白激酶功能结构域pkc和保守的gxgxxgxv模块，所述csmekk1-1蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示，通过调节柑橘属植物中csmekk1-1蛋白的表达水平，提高柑橘属植物对柑橘黄龙病的抗性。
2.根据权利要求1所述的抗柑橘黄龙病的非典型mekk蛋白csmekk1-1，其特征在于，编码csmekk1-1蛋白的核苷酸序列如seq id no：2所示。
3.根据权利要求1所述的抗柑橘黄龙病的非典型mekk蛋白csmekk1-1，其特征在于，调节csmekk1-1蛋白表达水平的具体方法为：上调柑橘属植物中csmekk1-1蛋白的表达水平，激活mapk信号通路。
4.根据权利要求3所述的抗柑橘黄龙病的非典型mekk蛋白csmekk1-1及抗病柑橘制备方法，其特征在于，上调柑橘属植物中csmekk1-1蛋白表达水平的方式采用过表达载体控制csmekk1-1基因在柑橘细胞中的表达，上调柑橘csmekk1-1蛋白的积累。
5.一种具有抗柑橘黄龙病的非典型mekk蛋白csmekk1-1的抗病柑橘制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的具有抗柑橘黄龙病的非典型mekk蛋白csmekk1-1的抗病柑橘制备方法，其特征在于，步骤(1)中，柑橘csmekk1-1基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总rna，然后反转录为cdna，最后采用高保真酶p...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹修平，董丽婷，商兰月，杜美霞，莫凯琴，许兰珍，龙琴，李强，何永睿，
申请(专利权)人：西部重庆科学城种质创制大科学中心，
类型：发明
国别省市：
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