【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及c12n9/14，具体为一种水解酶精纯品的制备方法及其应用。
技术介绍
1、酶解法作为单细胞悬液制备常用方法之一，通过利用特定酶进行相应的化学反应除掉一些特定结构，适合将小块组织消化成为单个细胞。组织解离常见的消化酶主要包括胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶ⅰ、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶，不同酶适用于不同的组织类型。中性蛋白酶(dispase)也称分散酶，来源于枯草杆菌，无支原体或其他动物病毒污染，具有比较温和的蛋白水解酶活性，对细胞损伤小且可维持细胞膜完整性，因此非常适合用于分离原代和继代细胞培养，中性蛋白酶还可用于消除悬浮细胞培养过程中发生的细胞聚集，常与胶原酶或其他蛋白酶结合使用。但是目前用于不同组织和器官的细胞分离的高纯度解离酶主要依赖国外进口。如中国专利(授权公告号为cn103757042b)公开了基于自聚集短肽诱导的固定化腈水解酶及制备方法和应用，中国专利(授权公告号为cn114645033b)公开了一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用，中国专利(授权公告号为cn102363775b)公开了一种纯化腈水解酶的方法，均未涉及从从枯草芽孢杆菌的发酵液中提取精制获得高纯度的中性蛋白水解酶的方法。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种从枯草芽孢杆菌的发酵液中提取精制获得高纯度的中性蛋白水解酶的方法，通过该方法精制的水解酶，可用于不同组织和器官的细胞分离，并可替代进口高纯度的解决了目前国内在制备原代脏器单细胞过程中，使用的高纯
2、本专利技术一方面提供了一种水解酶精纯品的制备方法，至少包括以下步骤：将枯草杆菌发酵液干粉溶解后离心，离心后获得上清液1和沉淀物1；向沉淀物1中加入纯化水搅拌沉淀物完全悬浮无结块后离心，离心后获得上清液2和沉淀物2，沉淀物2弃去；将上清液1、2混合后进行再次离心，离心后获得上清液3和沉淀物3，沉淀物3弃去；将上清液3进行抽滤获得料液，边搅拌边向料液中加入沉淀剂，加入完毕继续搅拌，然后密封置于冰箱中过夜；过夜后的料液离心后获得上清液4和沉淀物4，弃去上清液4，将沉淀物4用纯化水溶解后转移至容器中，获得水解酶粗提液，将水解酶粗提液进行脱盐、精纯后即得水解酶精纯品。
3、作为一种优选的技术方案，所述沉淀剂选自硫酸铵、硫酸钠、氯化钠中的一种，优选为硫酸铵；
4、作为一种优选的技术方案，所述沉淀剂与料液的体积比＞30％，优选为40％。
5、作为一种优选的技术方案，所述离心的条件为：6000-10000rpm，2-5℃，20-60min；优选为8000rpm，4℃，30min。
6、作为一种优选的技术方案，所述脱盐具体为：将g25色谱分离柱连接到aktapure150色谱制备系统上，从2～8℃冰箱中取出水解酶粗提液，过g25色谱分离柱，收集紫外吸收峰，获得脱盐料液。
7、作为一种优选的技术方案，所述精纯具体为：将ti-cha色谱分离柱连接到aktapure150色谱制备系统上，取脱盐料液，过ti-cha色谱分离柱，收集60％目标峰，获得水解酶精纯品，放置4℃冰箱中待检。
8、本专利技术提供的制备方法，通过将枯草杆菌发酵液干粉溶解后进行离心，然后将上清液1、2混合后进行再次离心获得上清液3，对上清液3进行抽滤后再加入沉淀剂沉淀，保证后续沉淀效果。专利技术人在探究过程中发现，在前述工艺控制的基础上，优选硫酸铵作为沉淀剂并进一步控制硫酸铵与料液的体积比为40％，确保沉淀完全，获得高酶活的水解酶粗提液。
9、进一步的，专利技术人通过对水解酶粗提液先进行脱盐处理后再进行精纯处理，有效分离目标蛋白，而将水解酶粗提液直接过过ti-cha柱，无60％目标峰，流穿料液依然表现出高浓度酶活性。尤其是控制精纯处理中色谱分离柱为ti-cha色谱分离柱，确保收集到的目标峰具有酶活性，而采用deae色谱分离柱，分步收集20％，40％，60％，80％，100％洗脱峰，并对收集液进行酶活检测，均无酶活性。
10、本专利技术另一方面提供了一种水解酶精纯品的制备方法的应用，应用于的水解酶精纯品的制备。
11、作为一种优选的技术方案，所述水解酶精纯品的纯度检测方法为：采用安捷伦1260infinity ii分析型液相色谱纯化系统，色谱检测条件为：流动相a为0.1wt％tfa水溶液，流动相b为0.1wt％tfa-高纯乙腈溶液，流速为1-1.5ml/min，检测器为uv280。
12、作为一种优选的技术方案，所述色谱检测的时间及梯度参见表1。
13、表1
14、 时间(min) a％(v/v) b％(v/v) 0.00 95.0 5.0 50.00 0.0 100.0 55.00 0.0 100.0 55.10 95.0 5.0 60.00 95.0 5.0
15、本专利技术通过采用安捷伦1260infinity ii分析型液相色谱纯化系统，控制色谱检测条件以及色谱检测的时间和梯度，实现本专利技术方法制备得到的水解酶精纯品纯度的检测，而使用sds-page常规蛋白纯度检测方法，无法判断水解酶精纯品的纯度。
16、作为一种优选的技术方案，所述水解酶精纯品的酶活检测方法为：先绘制酪氨酸标准曲线，然后进行酶活检测获得吸光度，最后将吸光度根据酪氨酸标准曲线获得酪氨酸浓度，通过公式计算酶活。
17、优选的，所述水解酶精纯品的酶活检测方法，包括以下步骤：
18、(1)绘制酪氨酸标准曲线：按下表2配制不同浓度的l-酪氨酸标准溶液，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度(a)。以吸光度a为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。
19、表2
20、
21、
22、(2)酶活检测
23、先将酪素溶液放入35±0.2℃恒温水浴中，预热5min，将水解酶精纯品用缓冲溶液稀释后获得酶液，按表3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：将枯草杆菌发酵液干粉溶解后离心，离心后获得上清液1和沉淀物1；向沉淀物1中加入纯化水搅拌沉淀物完全悬浮无结块后离心，离心后获得上清液2和沉淀物2，沉淀物2弃去；将上清液1、2混合后进行再次离心，离心后获得上清液3和沉淀物3，沉淀物3弃去；将上清液3进行抽滤获得料液，边搅拌边向料液中加入沉淀剂，加入完毕继续搅拌，然后密封置于冰箱中过夜；过夜后的料液离心后获得上清液4和沉淀物4，弃去上清液4，将沉淀物4用纯化水溶解后转移至容器中，获得水解酶粗提液，将水解酶粗提液进行脱盐、精纯后即得水解酶精纯品。
2.根据权利要求1所述的一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂选自硫酸铵、硫酸钠、氯化钠中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂与料液的体积比＞30％。
4.根据权利要求3所述的一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，所述离心的条件为：6000-10000rpm，2-5℃，20-60min。
5.根据权利要求4所述的一种水解酶
6.根据权利要求5所述的一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，所述精纯具体为：将Ti-CHA色谱分离柱连接到AKTApure150色谱制备系统上，取脱盐料液，过Ti-CHA色谱分离柱，收集60％目标峰，获得水解酶精纯品，放置4℃冰箱中待检。
7.一种根据权利要求1-6所述的水解酶精纯品的制备方法的应用，其特征在于，应用于的水解酶精纯品的制备。
8.根据权利要求7所述的水解酶精纯品的制备方法的应用，其特征在于，所述水解酶精纯品的纯度检测方法为：采用安捷伦1260Infinity II分析型液相色谱纯化系统，色谱检测条件为：流动相A为0.1wt％TFA水溶液，流动相B为0.1wt％TFA-高纯乙腈溶液，流速为1-1.5mL/min，检测器为UV280。
9.根据权利要求8所述的水解酶精纯品的制备方法的应用，其特征在于，所述水解酶精纯品的酶活检测方法为：先绘制酪氨酸标准曲线，然后进行酶活检测获得吸光度，最后将吸光度根据酪氨酸标准曲线获得酪氨酸浓度，通过公式计算酶活。
10.根据权利要求8所述的水解酶精纯品的制备方法的应用，其特征在于，所述酶活检测中缓冲溶液为PBS缓冲溶液或Tris-HCL缓冲溶液。
...【技术特征摘要】
1.一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：将枯草杆菌发酵液干粉溶解后离心，离心后获得上清液1和沉淀物1；向沉淀物1中加入纯化水搅拌沉淀物完全悬浮无结块后离心，离心后获得上清液2和沉淀物2，沉淀物2弃去；将上清液1、2混合后进行再次离心，离心后获得上清液3和沉淀物3，沉淀物3弃去；将上清液3进行抽滤获得料液，边搅拌边向料液中加入沉淀剂，加入完毕继续搅拌，然后密封置于冰箱中过夜；过夜后的料液离心后获得上清液4和沉淀物4，弃去上清液4，将沉淀物4用纯化水溶解后转移至容器中，获得水解酶粗提液，将水解酶粗提液进行脱盐、精纯后即得水解酶精纯品。
2.根据权利要求1所述的一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂选自硫酸铵、硫酸钠、氯化钠中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂与料液的体积比＞30％。
4.根据权利要求3所述的一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，所述离心的条件为：6000-10000rpm，2-5℃，20-60min。
5.根据权利要求4所述的一种水解酶精纯品的制备方法，其特征在于，所述脱盐具体为：将g25色谱分离柱连接到aktapure150色谱制备系统上，从2～8℃冰箱中取出水解酶粗...
【专利技术属性】
技术研发人员：敖永琴，谢宇杰，沈星语，郑李君，
申请(专利权)人：上海源培生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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