【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体地，涉及一种鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组、检测方法及其应用。
技术介绍
1、猫球虫病是由球虫寄生于猫小肠和大肠黏膜上皮细胞内引起的一种原虫病，可导致出血性肠炎、脱水、贫血、厌食、体重减轻和呕吐。猫球虫属于顶复器门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球虫目、艾美耳科、等孢球虫属，有猫等孢球虫和芮氏等孢球虫两种。猫发生球虫感染时，如果只从腹泻、血便、发热、脱水、厌食、消瘦等临床症状判断，极度容易被误诊为猫胃肠炎、猫瘟等，影响疾病的诊断与治疗。为了更准确地鉴别诊断猫球虫病，需要进行病原学诊断。猫等孢球虫卵囊呈蛋形或宽卵圆形，其寄生于小肠，主要在回肠的绒毛表面上皮细胞内。芮氏等孢球虫卵囊呈卵圆形或椭圆形，其寄生于整个小肠，在绒毛上皮细胞和李氏腺中均可见。猫等孢球虫的潜隐期比芮氏等孢球虫的长，其传染性比芮氏等孢球虫强，而其致病性比芮氏等孢球虫弱。由此可见，猫等孢球虫和芮氏等孢球虫在生物学特性和致病性有一定的差异，流行率可能也不同，因此，完成对这两种球虫的鉴别诊断是防控该疾病的一大关键。
2、目前应用于猫球虫检测的传统检测方法有直接涂片法、漂浮法和染色法等，其存在容易漏检、需要掌握一定寄生虫知识的人员、主观性较强以及感染强度较低时容易出现假阴性等问题。而应用于猫球虫的pcr检测方法包括常规pcr方法、巢式pcr方法和qpcr方法3种。常规pcr方法和巢式pcr方法不能鉴定出猫球虫的种类，需建立双重pcr方法，但常规双重pcr方法和双重巢式pcr方法操作繁琐，耗时长。使用taqman探针法qpcr
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组。
2、本专利技术的第二个目的在于提供一种鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测方法。
3、本专利技术的第三个目的在于提供所述鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组及检测方法的应用。
4、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
5、本专利技术基于猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的its-1序列设计特异性扩增引物，并根据引物是否能扩增出两种猫球虫、引物的敏感性和特异性以及是否能准确鉴别两种等孢球虫，筛选得到最优组ifits-f6/r6(猫等孢球虫)和irits-f6/r6(芮氏等孢球虫)，所得ifits-f6/r6和irits-f6/r6对猫等孢球虫和芮氏等孢球虫均有较高的敏感性，能够准确鉴别两种等孢球虫。
6、因此，本专利技术首先提供一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组，包括ifits-f6/r6和irits-f6/r6引物对；
7、所述ifits-f6/r6引物对，包括上游引物ifits-f6，其核苷酸序列如seq no.1所示：gggctggagcataatggatg；下游引物ifits-r6，其核苷酸序列如seqno.2所示：gcagaaatggaagtagacagct；
8、所述irits-f6/r6引物对，包括上游引物irits-f6，其核苷酸序列如seqno.3所示：gccgctttaagagcattagtcg；下游引物irits-r6，其核苷酸序列如seq no.4所示：ggggaccaaaacaggcag。
9、进一步地，所述ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为(5～6)：(3～6)。
10、进一步地，所述ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为6：(3～6)。
11、进一步地，所述ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为2:1。
12、优选地，ifits-f6/r6和irits-f6/r6引物对的引物浓度分别为0.6μmol/l和0.3μmol/l。
13、本专利技术提供任一所述双重pcr检测引物组合物在制备鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的检测试剂盒中的应用。
14、本专利技术提供一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的检测试剂盒，含有上述任一所述双重pcr检测引物组。
15、进一步地，所述检测试剂盒还含有双重pcr-hrm反应所需试剂。
16、优选地，所述双重pcr-hrm反应所需试剂包括但不限于2×hrm analysis premix、ddh2o等。
17、本专利技术提供任一所述双重pcr检测引物组在开发不以疾病诊断或治疗为目的的鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的pcr检测方法中的应用。
18、本专利技术提供一种用于非疾病诊断或治疗目的的鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr-hrm检测方法，包括以下步骤：
19、s1.提取检测样品dna；
20、s2.以步骤s1得到的样品dna为模板，采用上述任一所述双重pcr检测引物组进行双重pcr-hrm反应；
21、s3.根据步骤s2双重pcr-hrm反应的溶解曲线进行判别，若熔解曲线峰值大于12且熔解温度tm值在81.15℃～81.94℃，则可判定为猫等孢球虫阳性；若熔解曲线峰值大于19且熔解温度tm值在84.41℃～85.31℃，则可判定为芮氏等孢球虫阳性。
22、本专利技术基于上述用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组开发了一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr-hrm检测方法，并对引物浓度和退火温度的进行优化；建立的双重pcr-hrm检测方法具有良好的特异性及敏感性，双重pcr-hrm反应仅扩增猫等孢球虫和芮氏等孢球虫，对大肠杆菌、沙门氏菌、刚地弓形虫、隐孢子虫、狮弓蛔虫、猫弓首蛔虫、锡兰钩口钩虫、曼氏迭宫绦虫和猫瘟病毒等均不能扩增；猫等孢球虫可检测出的最低浓度为1.04×101copies/μl，芮氏等孢球虫可检测出的最低浓度为1.17×10-1copies/μl。建立的方法批内与批间重复阈值的变异系数均小于2％，重本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重PCR检测引物组，其特征在于，包括IFITS-F6/R6和IRITS-F6/R6引物对；
2.根据权利要求1所述双重PCR检测引物组，其特征在于，所述IFITS-F6/R6引物对和IRITS-F6/R6引物对的摩尔浓度比为(5～6)：(3～6)。
3.根据权利要求1所述双重PCR检测引物组，其特征在于，所述IFITS-F6/R6引物对和IRITS-F6/R6引物对的摩尔浓度比为6：(3～6)。
4.权利要求1～3任一所述双重PCR检测引物组在制备鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的检测试剂盒中的应用。
5.一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～3任一所述双重PCR检测引物组。
6.根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，还含有双重PCR-HRM反应所需试剂。
7.权利要求1～3任一所述双重PCR检测引物组在开发不以疾病诊断或治疗为目的的鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的PCR检测方法中的应用。
8.一种用于非疾病诊断或治
9.根据权利要求7所述双重PCR-HRM检测方法，其特征在于，步骤S2所述双重PCR-HRM反应的反应体系含有以下体积份数的各组分：20份2×HRM Analysis PreMix、2.4份IFITS-F6、2.4份IFITS-R6、1.2份IRITS-F6、1.2份IRITS-R6、11.8份样品DNA、11.8份ddH2O；其中引物IFITS-F6/R6、IRITS-F6/R6浓度为10μM。
10.根据权利要求7所述双重PCR-HRM检测方法，其特征在于，步骤S2所述双重PCR-HRM反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性10sec、56～58℃退火20sec、72℃延伸24sec，30个循环；熔解条件为95℃预变性1min；40℃退火1min，荧光信号采集从78℃到89℃，连续采集荧光15次/℃。
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组，其特征在于，包括ifits-f6/r6和irits-f6/r6引物对；
2.根据权利要求1所述双重pcr检测引物组，其特征在于，所述ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为(5～6)：(3～6)。
3.根据权利要求1所述双重pcr检测引物组，其特征在于，所述ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为6：(3～6)。
4.权利要求1～3任一所述双重pcr检测引物组在制备鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的检测试剂盒中的应用。
5.一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～3任一所述双重pcr检测引物组。
6.根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，还含有双重pcr-hrm反应所需试剂。
7.权利要求1～3任一所述双重pcr检测引物组在开发不以疾病诊断或治疗为目的的鉴定猫等孢球虫和...
【专利技术属性】
技术研发人员：林瑞庆，卢逸雄，张汉云，张媛，陆肖，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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