利用喷墨打印技术制备梯度蛋白模版的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用喷墨打印技术制备梯度蛋白模版的方法，首先将喷墨打印机进行改装并优化设计打印模版的灰度梯度，然后以喷金硅片作为初始基材，以优化所得的灰度梯度为基准将端－ＣＯＯＨ基的硫醇分子打印到喷金初始基材上，将打印后的基材依次进行反浸处理和活化处理，最后与目标蛋白进行偶联固定，得到所需的梯度蛋白打印模版；本发明专利技术方法操作简单，只需普通喷墨打印机即可满足需求，并且加工成本低，易于操作，能够避免基材的交叉污染，本方法可用于不同蛋白的梯度打印模版构建以获得生长因子，实现相应的表面固载的蛋白或生长因子梯度的制备，在未来组织工程研究中具有广阔的应用前景。

Method for preparing gradient protein template by using ink-jet printing technique

The invention discloses a method for preparing gradient protein template by ink-jet printing system, the gray gradient modification and optimization design of inkjet printer print template, and then by spraying silicon as the initial substrate, with gray gradient optimized baseline thiols print end - COOH group to spraying the initial substrate on the substrate after printing followed by anti dip treatment and activation treatment, and finally the target protein coupling fixed, gradient template protein required; the method of the invention has the advantages of simple operation, only ordinary ink-jet printer can meet the demand, and low processing cost, easy operation, to avoid cross contamination of the substrate and this method can be used to print the template construction of different protein gradient to obtain growth factor, the realization of the corresponding surface immobilized protein or growth factor Preparation of sub gradient has broad application prospects in tissue engineering research in the future.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及血液感染病原菌的检测方法，特别涉及一种。
技术介绍
在过去的几十年中，尽管组织工程已经取得了很大发展，但许多挑战仍然存在。植入体在植入宿主后的微循环血管新生便是其中之一 (Science, 2002， 295 :1009-1014)。血管新生对于生物材料的成功植入和组织工程化构建非常必要，因为新生血管能够为它们持久发挥功能提供所需的养分和氧气。而内皮细胞的迁移和取向排列在血管生成的脉管重塑过程中发挥着非常必要且重要的作用。其原理是，内皮细胞自身的特异蛋白酶降解细胞外基质后，迁移进入血管周边区域进行增殖、排列形成新血管。 内皮细胞的迁移和取向排列可以通过不同机制进行调控，比如，力学趋化性，和化学趋化性。趋化性指的是细胞沿一个具有化学浓度梯度的表面特定的运动或取向。血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子_2(FGF-2)等可溶性生长因子的浓度梯度都能很好地介导内皮细胞取向排列。但在组织工程应用方面，材料表面偶联梯度蛋白或多肽的材料在模拟生物微环境研究中尤其重要，它有利于开发具有生物传导性的支架材料。 表面梯度是指在特定距离上，物体表面化学或物理属性逐渐变化的一种状态。体外研究内皮细胞迁移和取向性方面，梯度构建技术起着至关重要的作用。Genzer等利用扩散原理(Advanced Material, 2005， 17 :2802-2807)，首先在硅片上形成聚合引发剂梯度，进而引发聚合反应，构建聚羟乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)梯度模版，然后通过化学反应偶联纤粘蛋白(FN)，最终得到纤粘蛋白浓度梯度模版，用于研究了成骨细胞的粘附、伸展及趋向性行为。在另一研究中，Heiko等(Langmuir，2005，21 :7796-7804)报道了利用液体在固体中扩散来形成梯度的方法。所用固体介质为二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)，首先构造一特定模具，当硫醇溶液在重力作用下透过PDMS向下扩散时，由于PDMS的厚度不同，沿PDMS基材径向吸附不同量的硫醇溶液，在将该PDMS模版压印在金膜表面，进而形成了硫醇梯度，利用硫醇官能化基团固定蛋白质，形成了梯度蛋白模版。 但是，这些方法都有明显缺陷，比如成本高、难于操作、易于污染和定量化。本专利技术旨在引入喷墨打印技术制备梯度蛋白模版，进而应用于细胞运动性研究。喷墨打印技术具有高度自动化、成本低及高重复性等优点，同时，喷墨打印技术是一种非接触方法，操作中，打印机喷嘴和基材并不直接接触，大大降低了交叉污染的风险。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种，利用喷墨打印技术设计具有高度重复性及可靠性的梯度蛋白模版以便用于细胞运动性研究，本专利技术的方法操作简单、成本低廉、实施容易，可应用于不同蛋白的梯度模版构建。 本专利技术所述的，包括如下步骤 a.对喷墨打印机进行改装，步骤为将喷射液装入带有芯片的空墨盒后再将墨盒装于打印机上，以至少两个由虹吸管连接起来的容器作为连续供墨系统，所述连续供墨系统一端与墨盒连通，另一端与喷射液贮池连通，所述喷射液为0. 25-2mM端-C00H基硫醇的有机溶液； b.依据灰度值与标准图案的静态接触角的关系优化设计打印模版的灰度梯度，得线性优化灰度区间； c.以喷金硅片作为初始基材、以线性优化灰度区间的灰度梯度为基准将端-COOH基的硫醇分子打印到初始基材上； d.将打印所得的基材于反浸液中反浸5-30min后再于EDC/NHS体系中活化处理5-30min，所述反浸液为浓度不低于0. 2mM的端-OH基硫醇的有机溶液； e.将活化所得的基材与目标蛋白进行偶联，得梯度蛋白模版。 进一步，所述线性优化灰度区间的具体设计方法如下 (1)设计0-255区间的灰度值； (2)以饱和端-COOH基硫醇的有机溶液为喷射液J人0-255灰度值中筛选不同灰度值并以所筛选的灰度值为基准打印图案，以所得图案作为标准图案分别测量相应灰度图案的静态接触角，依据灰度值与静态接触角的关系作曲线，得线性优化灰度区间； 进一步，所述喷射液为0. 25_2mM的1_巯基i^一烷酸的有机溶液； 进一步，所述喷金硅片的硅片表面由内向外依次为厚度不低于lnm的铬层和50-200nm厚的金层，金层纯度不小于99. 99% ;进一步，所述反浸液为O. 25-2mM的11-巯基-l-i^一醇的有机溶液，所述EDC/NHS体系pH为5. 5，体系中所含组分及相应组分在体系中的浓度分别为醋酸缓冲液0. 2-lM、碳化二亚胺2-10mg/mL和N-羟基琥珀酰亚胺2-10mg/mL ; 进一步，步骤e所述的偶联通过如下步骤实现 ①将活化所得的基材浸入0-2(TC的蛋白溶液中浸泡1-36小时，基材上未反应的位点以0. 05-2mg/mL白蛋白溶液封闭，所述蛋白溶液中所含组分及相应组份在溶液中的浓度分别为Na2HP04 10mM、NaCl 138mM、KCl 2. 7mM、KH2P04l. 76mM和蛋白5-50 ii g/mL，所述蛋白为层粘蛋白、胶原蛋白和纤粘蛋白；②水洗步骤①所得基材，然后用浓度为0. 5-2M NaOH溶液震荡冲洗5-30min，最后再于pH7. 4的磷酸盐缓冲液中浸泡5-30min，最后得梯度蛋白打印模版。 进一步， 步骤a中所述容器为两个，所述喷射液为0. 25-2mM的1_巯基十一烷酸的乙醇溶液； 步骤b所述线性优化灰度区间的设计方法为利用Photoshop或PowerPoint软件设计0-255下的灰度图像，以饱和端-COOH基硫醇的乙醇溶液为喷射液J人0-255灰度值中筛选不同灰度值并以所筛选的灰度值为基准打印图案，以所得图案作为标准图案分别测量相应灰度图案的静态接触角，依据灰度值与静态接触角的关系作曲线，得线性优化灰度区间； 步骤c所述喷金硅片外表面由内向外依次为厚度不低于lnm的铬层和50-200nm厚的金层，所述金层纯度不小于99. 99% ; 步骤d所述反浸液为0. 25-2mM的11_巯基_1_ i^一醇的乙醇溶液，所述EDC/NHS体系pH为5. 5，体系中所含组分及相应组分在体系中的浓度分别为醋酸缓冲液0. 2-lM、碳化二亚胺2-10mg/mL和N_羟基琥珀酰亚胺2-10mg/mL ; 步骤e所述将活化所得的基材与目标蛋白进行偶联的操作方法为将活化所得基材浸入0-2(TC的蛋白溶液中浸泡1-36小时，基材上未反应的位点以0. 05-2mg/mL白蛋白溶液封闭，所述蛋白溶液中所含组分及相应组份在溶液中的浓度分别为Na2HP04 10mM、NaCl 138mM、 KC1 2. 7mM、 KH2P04 1. 76mM和蛋白5-50 ii g/mL，所述蛋白为层粘蛋白、胶原蛋白或纤粘蛋白；然后再水洗与蛋白偶联后的基材，再用浓度为O. 5-2M的NaOH溶液震荡冲洗5-30min，最后于pH7. 4的磷酸盐缓冲液中浸泡5-30min，最后得梯度蛋白模版。 本专利技术所述端-COOH基硫醇为分子一端带有-COOH的硫醇，端-OH基硫醇为分子一端带有-OH的硫醇，所述EDC为碳化二亚胺，所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺。 本专利技术的有益效果是 本专利技术的，首先将喷墨打印机进行改装并优化设计打印模版的灰度梯度，然后以喷金硅片作为初始基材，以优化所得的灰度梯度为基准将一端为-COO本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用喷墨打印技术制备梯度蛋白模版的方法，其特征在于：包括如下步骤：　　ａ．对喷墨打印机进行改装，步骤为：将喷射液装入带有芯片的空墨盒后再将墨盒装于打印机上，以至少两个由虹吸管连接起来的容器作为连续供墨系统，所述连续供墨系统一端与墨盒连通，另一端与喷射液贮池连通，所述喷射液为０．２５－２ｍＭ端－ＣＯＯＨ基硫醇的有机溶液；　　ｂ．依据灰度值与标准图案的静态接触角的关系优化设计打印模版的灰度梯度，得线性优化灰度区间；　　ｃ．以喷金硅片作为初始基材、以线性优化灰度区间的灰度梯度为基准将端－ＣＯＯＨ基的硫醇分子打印到初始基材上；　　ｄ．将打印所得的基材于反浸液中反浸５－３０ｍｉｎ后再于ＥＤＣ／ＮＨＳ体系中活化处理５－３０ｍｉｎ，所述反浸液为浓度不低于０．２ｍＭ的端－ＯＨ基硫醇的有机溶液；ｅ．将活化所得的基材与目标蛋白进行偶联，得梯度蛋白模版。

【技术特征摘要】
利用喷墨打印技术制备梯度蛋白模版的方法，其特征在于包括如下步骤a.对喷墨打印机进行改装，步骤为将喷射液装入带有芯片的空墨盒后再将墨盒装于打印机上，以至少两个由虹吸管连接起来的容器作为连续供墨系统，所述连续供墨系统一端与墨盒连通，另一端与喷射液贮池连通，所述喷射液为0.25-2mM端-COOH基硫醇的有机溶液；b.依据灰度值与标准图案的静态接触角的关系优化设计打印模版的灰度梯度，得线性优化灰度区间；c.以喷金硅片作为初始基材、以线性优化灰度区间的灰度梯度为基准将端-COOH基的硫醇分子打印到初始基材上；d.将打印所得的基材于反浸液中反浸5-30min后再于EDC/NHS体系中活化处理5-30min，所述反浸液为浓度不低于0.2mM的端-OH基硫醇的有机溶液；e.将活化所得的基材与目标蛋白进行偶联，得梯度蛋白模版。2. 根据权利要求1所述的利用喷墨打印技术制备梯度蛋白模版的方法，其特征在于所述线性优化灰度区间的具体设计方法如下(1) 设计0-255区间的灰度值；(2) 以饱和端-COOH基硫醇的有机溶液为喷射液J人0-255灰度值中筛选不同灰度值并以所筛选的灰度值为基准打印图案，以所得图案作为标准图案分别测量相应灰度图案的静态接触角，依据灰度值与静态接触角的关系作曲线，得线性优化灰度区间。3. 根据权利要求2所述的利用喷墨打印技术制备梯度蛋白模版的方法，其特征在于所述喷射液为浓度为0. 25-2mM的1-巯基i^一烷酸的有机溶液。4. 根据权利要求2所述的利用喷墨打印技术制备梯度蛋白模版的方法，其特征在于所述喷金硅片的硅片表面由内向外依次为厚度不低于lnm的铬层和50-200nm厚的金层，金层纯度不小于99. 99%。5. 根据权利要求2所述的利用喷墨打印技术制备梯度蛋白模版的方法，其特征在于所述反浸液为浓度为0. 25-2mM的11-巯基-1- i^一醇的有机溶液，所述EDC/NHS体系pH为5.5，体系中所含组分及相应组分在体系中的浓度分别为醋酸缓冲液0. 2-lM、碳化二亚胺2-10mg/mL和N_羟基琥珀酰亚胺2-10mg/mL。6. 根据权利要求2所述的利用喷墨打印技术制备梯度蛋白模版的方法，其特征在于步骤e所述的偶联通过如下步骤实现① 将活化所得的基材浸入0-2(TC的蛋白溶液中浸泡1...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡开勇，董海德，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]