【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，具体地说，涉及一种血红素加氧酶突变体及其应用。
技术介绍
1、胆绿素(biliverdin)，又称去氢胆红素，是一种线性四吡咯色素。在脊椎动物体内，衰老的红细胞在单核吞噬细胞系统的作用下，释放出血红蛋白，血红蛋白随后被分解成珠蛋白和血红素。血红素在血红素加氧酶(heme oxygenase)的作用下，将铁卟啉环的α-亚甲基桥氧化断裂形成胆绿素。随后胆绿素进一步被胆绿素还原酶(biliverdin reductase)还原，生成胆红素，由此可见胆绿素可以作为生产胆红素的原料。
2、胆红素是重要药材牛黄的主要成分之一，还是中国药典中记载的100多种中成药制剂的主要成份，市场需求量巨大。目前胆红素的生产方法主要有两种：一是动物药源提取法，即从猪、牛等动物的胆汁中提取胆红素，这是目前市场上胆红素的主要生产方法。但是天然胆红素在动物胆汁中的含量甚微，例如猪胆汁中胆红素含量约为万分之五，提取1公斤胆红素至少需要5吨的猪胆，导致生产胆红素的成本较高且不可持续。另一种方法是酶法合成，即利用胆绿素为原料通过酶法合成胆红素，生物法具有反应条件温和、产物光学纯度高等优点，具有良好的工业应用前景。
3、由于天然的胆绿素获取比较困难，早期都是通过化学法直接合成，但是化学方法生产会引入胆绿素的多种同分异构体，造成目标产物纯度不高，下游分离纯化的难度很大。随后，许多研究开始转向利用酶法合成胆绿素，酶法是利用商业化的氯化血红素为底物，在血红素加氧酶的作用下，氧化生成胆绿素。由此合成的胆绿素可以作为原料进一步制备胆
4、
5、2012年，美国犹他州立大学jon y takemoto从蓝藻(synechocystis pcc6803)克隆获得一个血红素加氧酶基因，将其成功在大肠杆菌表达，并用于体外生物转化血红素合成胆绿素，胆绿素的滴度仅达到23.5mg/l(bmc biotechnology,2012:12:1-10)。专利文献cn109182232a报道了一种能表达来源于集胞藻(synechocystis sp.)血红素加氧酶基因的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌经诱导表达培养后，在培养液中加入氯化血红素作为底物，在胞内血红素加氧酶的催化作用下，用于生物转化法制备胆绿素，最终转化体系中的胆绿素产量可达61.7mg/l，氯化血红素的摩尔转化率为34.5％。专利cn114891711a报道了一种能表达破伤风梭状芽孢杆菌(clostridium tetani)来源的血红素加氧酶的重组大肠杆菌，在其胞内构建了辅酶循环系统和膜表面展示系统，来增大血红素加氧酶和底物血红素之间的接触，以提高转化效率、缩短转化时间，从而实现微生物法高效催化合成胆绿素，最终胆绿素产量达到76.3mg/l(生物工程学报,2022,38:2581-2593)。专利文献cn116676204a公开了一种重组酵母基因工程菌及其在生物转化法合成胆绿素中的应用，该重组酵母基因工程菌以巴斯德毕赤酵母为宿主菌，过表达拟南芥(arabidopsis thaliana)来源的血红素加氧酶，以该重组毕赤酵母基因工程菌为催化剂，以氯化血红素为底物，生物转化法合成胆绿素，胆绿素转化得率可以达到132mg/l，是目前报道的生物法合成胆绿素的最高产量，然而转化率仅为18.5％。
技术实现思路
1、我们对于上述现有技术的多种来源的血红素加氧酶包括蓝藻(synechocystispcc6803)、集胞藻(synechocystis sp.)、破伤风梭状芽孢杆菌(clostridium tetani)、拟南芥(arabidopsis thaliana)等来源的血红素加氧酶进行了研究，发现这些血红素加氧酶在呈游离状态催化氯化血红素反应合成胆绿素时，表现的氧化酶活力较低，适用的底物浓度很低，甚至不能高于0.3g/l，没有实际应用的可能性。
2、考虑到酶催化法即游离酶或固定化酶催化法具有反应体系成分明晰、反应条件容易控制、后处理工序简单方便、产物容易分离纯化等优势，我们重点研究了游离酶催化方法。为此对于众多生物来源的血红素加氧酶或同工酶进行了广泛调研，通过对六十多种来源血红素加氧酶的进行实验比较，筛选出氧化活力高、底物和产物耐受浓度高的血红素加氧酶，发现一种棒状杆菌corynebacterium sp.来源的血红素加氧酶(ncbi号：wp_014319205.1)是其中的佼佼者。进一步地，为了提高其酶活力，我们还通过易错pcr的随机突变方法对该酶进行突变，还得到了一些酶活力进一步提高的突变体。因此，本专利技术包括如下技术方案。
3、一种酶催化制备胆绿素的方法，包括如下步骤：
4、以氯化血红素为底物，使用棒状杆菌corynebacterium sp.来源的血红素加氧酶(氨基酸序列为seq id no:2，ncbi号：wp_014319205.1，本文中命名为coho)或者其酶活力提高的突变体催化氧化反应，得到胆绿素。
5、mttataglavelkqstaqahekaehstfmsdllkgrlgvaeftrlqeqawlfytaleqavdavrasgfaeslldpalnraevlardldklngssewrsritaspavidyvnrleeirdnvdgpalvahhyvrylgdlsggqviarmmqrhygvdpealgfyhfegiaklkvykdeyreklnnlelsdeqrehllkeatdafvfnhqvfadlgkgl(seqid no:2)。
6、该酶催化方法中，反应体系中可以添加有葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶nadp+(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，辅酶ii)或nad+(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，即辅酶i)，以便促进氧化反应。
7、上述葡萄糖脱氢酶可以是常用的葡萄糖脱氢酶比如市售酶制剂，例如是来源于巨大芽孢杆菌bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶(journal of biological chemistry,1989,264:6381-6385)。
8、在一种实施方式中，上述血红素加氧酶或者其突变体呈现为酶形式，比如为游离酶或者固定化酶。
9、可替代地，上述血红素加氧酶或突变体也可以呈现为其表达微生物菌体形式。
10、上述反应体系可以为缓冲溶液例如磷酸盐缓冲溶液，ph值可以为6.0-9.0，优选ph7.0-8.5，例如为ph8.0左右；
11、反应温度可以为20-35℃，优选25-32℃，例如为30℃左右。
12、例如，上述氧化反应的条件可以为：底物氯化血红素浓度为0.1～1g/l，葡萄糖用量为1～10g/l，催化量的血红素加氧酶或其突变体，葡萄糖脱氢酶的用量为0.5～1.5g/l，nadp+用量为0.05～0.2mm，反应液水相ph为6.0～9.0，反应温度为20～35℃，反应过程中通入持续氧气或空气；所述的氧化反应的时间以反应转化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酶催化制备胆绿素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中添加有葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP+或NAD+。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红素加氧酶或者其突变体呈现为酶形式或者表达微生物菌体形式。
4.一种如权利要求1中所述的血红素加氧酶突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列SEQ ID NO:2中的下述位点发生突变后所形成的突变体：第34位赖氨酸、第54位苏氨酸、第60位缬氨酸、第93位丝氨酸、第101位苏氨酸、第122位甘氨酸、第143位异亮氨酸、第167位丙氨酸、第178位谷氨酸、第199位天冬氨酸、或者它们中两种以上的组合，该血红素加氧酶突变体具有血红素加氧酶SEQ ID NO:2的功能。
5.如权利要求4所述的血红素加氧酶突变体，其特征在于，其为选自下述的多肽：
6.编码如权利要求5中所述血红素加氧酶突变体SEQ ID NO:3的基因。
7.如权利要求6所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
<...【技术特征摘要】
1.一种酶催化制备胆绿素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中添加有葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶nadp+或nad+。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红素加氧酶或者其突变体呈现为酶形式或者表达微生物菌体形式。
4.一种如权利要求1中所述的血红素加氧酶突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列seq id no:2中的下述位点发生突变后所形成的突变体：第34位赖氨酸、第54位苏氨酸、第60位缬氨酸、第93位丝氨酸、第101位苏氨酸、第122位甘氨酸、第143位异亮氨酸、第167位丙氨酸、第178位谷氨酸、第199位天冬...
【专利技术属性】
技术研发人员：张仙，游智能，贺松，薛江涛，郑明坤，戴忆思，葛丽蓉，
申请(专利权)人：上海百福安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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