【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学，特别涉及一种间质细胞自噬模型的建立方法。
技术介绍
1、gerd是指胃内容物反流至食管而引起反酸、烧心一系列症状和/或不适的疾病。该病全球患病率约为13.98％，并呈上升趋势，且容易反复，可增加食管癌、间质性肺炎等多种疾病的发病风险，严重危害患者的身心健康。因此，该病仍是目前行业重点关注的公共卫生问题之一。大量证据表明，胃食管动力障碍是gerd发病主要原因之一。作为特殊的消化道起搏器细胞，cajal间质细胞(interstitial cells of cajal，iccs)启动有节奏的生物电慢波触发消化道收缩与蠕动，以维持消化道正常运动功能。iccs功能缺失是引起消化道动力障碍而致病的主要原因。自噬是一种依赖于溶酶体自行降解细胞内成分的分解代谢过程。生理情况下，细胞自噬可将损伤的细胞器和细胞进行清理，维持机体的稳态。当自噬过度时，可破坏细胞结构，导致细胞功能缺失。课题组前期动物实验已证实，胃食管iccs自噬是引发gerd的关键病理机制。食管iccs自噬模型是研究gerd病理分子机制和药物作用机理的一种重要手段。现有技术中缺乏iccs自噬模型相关的建立方法。有鉴于此，特提出一种间质细胞自噬模型的建立方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种间质细胞自噬模型的建立方法，其能够实现间质细胞自噬模型的建立。
2、本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
3、一种间质细胞自噬模型的建立方法，包括如下步骤：
4、原
5、免疫荧光鉴定；
6、分组与干预：取生长对数期iccs，经胰酶消化离心后计数，并接种2×105个细胞至25c㎡的细胞培养瓶中，贴壁24h后，更换培养基；将iccs分为0μm组、25μm组、50μm组、75μm组、100μm组，分别给予0μm、25μm、50μm、75μm、100μm浓度的脱氧胆酸诱导3h；
7、活性检测；
8、蛋白相对表达水平检测；
9、转录水平检测；
10、超微结构观察；
11、lc3及beclin-1表达量检测。
12、在一个优选实施例中，原代分离与培养具体包括：在无菌条件下取出食管，置于含双抗的pbs液中，剥除外膜，去除黏膜及黏膜下层，得肌层，将肌层剪成1-2mm3小块，自然沉降弃上清，加入0.1％ⅱ型胶原酶消化液，37℃水浴锅消化30min，吸出的上清酶液置于完全培养基中4℃保存，加入新的消化液，37℃水浴箱消化30min，将第二次消化后的组织悬液与前面的消化液混匀，过100目细胞筛，收集滤液300g，5min得细胞沉淀，pbs洗一遍后加入完全培养基重悬后铺板，置37℃、5％co2培养箱培养，此后每2～3d换液一次，倒置显微镜下观察细胞形态变化。
13、在一个优选实施例中，免疫荧光鉴定具体包括：在培养板中将已爬好细胞的培养皿用pbs浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定15min，pbs浸洗培养皿3次，每次3min；pbs浸洗培养皿3次，每次5min，用移液枪吸干培养皿内的pbs，在培养皿内滴加5％bsa，37℃封闭30min；用移液枪吸干培养皿内的封闭液，不洗，每个培养皿滴加足够量一抗cd117，4℃冰箱过夜，滴加荧光二抗cy3，37℃孵育30min，pbs充分淋洗，用移液枪吸干培养皿内的pbs，在培养皿内滴加5％bsa，37℃封闭30min，滴加dapi避光孵育3min，对标本进行染核，用pbs冲洗，置于荧光显微镜下观察并采集图像。
14、在一个优选实施例中，活性检测具体包括：各组iccs分别加入0μm、25μm、50μm、75μm、100μm浓度的脱氧胆酸诱导3h后，将待测的96孔板细胞换成相同的培养基，每孔100ul，每孔加入10ulcck8试剂，置于培养箱中孵育2h，酶标仪在450nm波长处检测每孔的吸光值。
15、在一个优选实施例中，蛋白相对表达水平检测具体包括：iccs经不同浓度脱氧胆酸诱导3h后，pbs洗涤3次，每次5min，弃掉培养皿中细胞培养液，每孔加入200μl的细胞裂解液，用细胞刮将细胞刮至一侧，移液枪吸入已做好标记的ep管中；细胞破碎仪使细胞完全破碎；12000r/min高速离心机离心10min，取上清液，bca法测量蛋白浓度，蛋白经10％sds-page分离胶和5％sds-page浓缩胶分离后转移至pvdf膜，用300ma恒流转膜；3％的脱脂牛奶封闭液封闭pvdf膜1h，将pvdf膜孵育一抗β-actin、lc3-ii/i一抗过夜；过夜孵育后的pvdf膜使用tbst洗涤3次，每次5min；将pvdf膜孵育二抗2小时，tbst洗涤3次后，配置发光液，用发光液浸湿pvdf膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统样品放置区运行程序显影成像
16、在一个优选实施例中，转录水平检测具体包括：采用trizon试剂提取组织/细胞中的总rna，采用rna超纯提取试剂盒提取mrna，利用紫外可见分光光度计测定mrna的浓度和纯度，通过rna逆转录试剂盒合成cdna，采用荧光pcr仪进行荧光定量pcr。
17、在一个优选实施例中，超微结构观察具体包括：iccs经不同浓度脱氧胆酸诱导3h后，pbs洗涤3次，每次3min；使用胰蛋白酶消化细胞并收集离心去上清，最后加入3％戊二醛、1％锇酸双重固定，丙酮逐级脱水及二甲酸二丙烯酯包埋，超薄切片处理，使用透射电镜进行观察和摄图。
18、在一个优选实施例中，lc3及beclin-1表达量检测具体包括：iccs用pbs浸洗3次后用4％的多聚甲醛固定15min，pbs浸洗培养皿3次，每次3min；0.5％triton x-100室温通透20min；pbs浸洗培养皿3次，每次5min，吸移液枪吸干培养皿中的pbs，在培养皿中滴加5％bsa，37℃封闭30min；用移液枪吸干培养皿内的封闭液，不洗，每个培养皿滴加足够量的稀释好的一抗:beclin-1，lc3，4℃冰箱过夜；取出培养皿，室温复温45min，pbs浸洗培养皿3次，每次5min，滴加稀释好的荧光二抗cy3，37℃孵育30min，pbs充分淋洗；滴加dapi避光孵育3min，对标本进行染核，用pbs冲洗多余的dapi，用50％甘油封闭培养皿；置于荧光显微镜下观察并采集图像。
19、在一个优选实施例中，所述培养皿中包含本体、磁性膜片和鼓动膜片，所述磁性膜片包括基体和多个磁片，所述多个磁片贴在所述基体上，且均匀分布，所述鼓动膜片的边缘设有黏贴边，所述基体和所述鼓动膜片采用橡胶材料制成，所述磁性膜片铺设于所述本体的底部，所述鼓动膜片覆盖于所述磁性膜片上，所述黏贴边贴合所述本体的内侧壁。
20、在一个优选实施例中，所述培养皿还包括安置座，所述安置座包括座体和磁块，所述座体上设有安置槽，所述安置槽的侧壁上设有安置台阶，所述磁块设于所述安置槽中，所述本体置于所述安置台阶上。
21、iccs为间质细胞。
2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，原代分离与培养具体包括：在无菌条件下取出食管，置于含双抗的PBS液中，剥除外膜，去除黏膜及黏膜下层，得肌层，将肌层剪成1-2mm3小块，自然沉降弃上清，加入0.1％Ⅱ型胶原酶消化液，37℃水浴锅消化30min，吸出的上清酶液置于完全培养基中4℃保存，加入新的消化液，37℃水浴箱消化30min，将第二次消化后的组织悬液与前面的消化液混匀，过100目细胞筛，收集滤液300g，5min得细胞沉淀，PBS洗一遍后加入完全培养基重悬后铺板，置37℃、5％CO2培养箱培养，此后每2～3d换液一次，倒置显微镜下观察细胞形态变化。
3.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，免疫荧光鉴定具体包括：在培养板中将已爬好细胞的培养皿用PBS浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗培养皿3次，每次3min；PBS浸洗培养皿3次，每次5min，用移液枪吸干培养皿内的PBS，在培养皿内滴加5％BSA，37℃封
4.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，活性检测具体包括：各组ICCs分别加入0μM、25μM、50μM、75μM、100μM浓度的脱氧胆酸诱导3h后，将待测的96孔板细胞换成相同的培养基，每孔100ul，每孔加入10ulCCK8试剂，置于培养箱中孵育2H，酶标仪在450nm波长处检测每孔的吸光值。
5.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，蛋白相对表达水平检测具体包括：ICCs经不同浓度脱氧胆酸诱导3h后，PBS洗涤3次，每次5min，弃掉培养皿中细胞培养液，每孔加入200μL的细胞裂解液，用细胞刮将细胞刮至一侧，移液枪吸入已做好标记的EP管中；细胞破碎仪使细胞完全破碎；12000r/min高速离心机离心10min，取上清液，BCA法测量蛋白浓度，蛋白经10％SDS-PAGE分离胶和5％SDS-PAGE浓缩胶分离后转移至PVDF膜，用300mA恒流转膜；3％的脱脂牛奶封闭液封闭PVDF膜1h，将PVDF膜孵育一抗β-actin、LC3-II/I一抗过夜；过夜孵育后的PVDF膜使用TBST洗涤3次，每次5min；将PVDF膜孵育二抗2小时，TBST洗涤3次后，配置发光液，用发光液浸湿PVDF膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统样品放置区运行程序显影成像。
6.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，转录水平检测具体包括：采用Trizon试剂提取组织/细胞中的总RNA，采用RNA超纯提取试剂盒提取mRNA，利用紫外可见分光光度计测定mRNA的浓度和纯度，通过RNA逆转录试剂盒合成cDNA，采用荧光PCR仪进行荧光定量PCR。
7.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，超微结构观察具体包括：ICCs经不同浓度脱氧胆酸诱导3h后，PBS洗涤3次，每次3min；使用胰蛋白酶消化细胞并收集离心去上清，最后加入3％戊二醛、1％锇酸双重固定，丙酮逐级脱水及二甲酸二丙烯酯包埋，超薄切片处理，使用透射电镜进行观察和摄图。
8.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，LC3及Beclin-1表达量检测具体包括：ICCs用PBS浸洗3次后用4％的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗培养皿3次，每次3min；0.5％Triton X-100室温通透20min；PBS浸洗培养皿3次，每次5min，吸移液枪吸干培养皿中的PBS，在培养皿中滴加5％BSA，37℃封闭30min；用移液枪吸干培养皿内的封闭液，不洗，每个培养皿滴加足够量的稀释好的一抗:Beclin-1，lc3，4℃冰箱过夜；取出培养皿，室温复温45min，PBS浸洗培养皿3次，每次5min，滴加稀释好的荧光二抗Cy3，37℃孵育30min，PBS充分淋洗；滴加DAPI避光孵育3min，对标本进行染核，用PBS冲洗多余的DAPI，用50％甘油封闭培养皿；置于荧光显微镜下观察并采集图像。
9.根据权利要求3或8所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，所述培养皿中包含本体、磁性膜片和鼓动膜片，所述磁性膜...
【技术特征摘要】
1.一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，原代分离与培养具体包括：在无菌条件下取出食管，置于含双抗的pbs液中，剥除外膜，去除黏膜及黏膜下层，得肌层，将肌层剪成1-2mm3小块，自然沉降弃上清，加入0.1％ⅱ型胶原酶消化液，37℃水浴锅消化30min，吸出的上清酶液置于完全培养基中4℃保存，加入新的消化液，37℃水浴箱消化30min，将第二次消化后的组织悬液与前面的消化液混匀，过100目细胞筛，收集滤液300g，5min得细胞沉淀，pbs洗一遍后加入完全培养基重悬后铺板，置37℃、5％co2培养箱培养，此后每2～3d换液一次，倒置显微镜下观察细胞形态变化。
3.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，免疫荧光鉴定具体包括：在培养板中将已爬好细胞的培养皿用pbs浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定15min，pbs浸洗培养皿3次，每次3min；pbs浸洗培养皿3次，每次5min，用移液枪吸干培养皿内的pbs，在培养皿内滴加5％bsa，37℃封闭30min；用移液枪吸干培养皿内的封闭液，不洗，每个培养皿滴加足够量一抗cd117，4℃冰箱过夜，滴加荧光二抗cy3，37℃孵育30min，pbs充分淋洗，用移液枪吸干培养皿内的pbs，在培养皿内滴加5％bsa，37℃封闭30min，滴加dapi避光孵育3min，对标本进行染核，用pbs冲洗，置于荧光显微镜下观察并采集图像。
4.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，活性检测具体包括：各组iccs分别加入0μm、25μm、50μm、75μm、100μm浓度的脱氧胆酸诱导3h后，将待测的96孔板细胞换成相同的培养基，每孔100ul，每孔加入10ulcck8试剂，置于培养箱中孵育2h，酶标仪在450nm波长处检测每孔的吸光值。
5.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，蛋白相对表达水平检测具体包括：iccs经不同浓度脱氧胆酸诱导3h后，pbs洗涤3次，每次5min，弃掉培养皿中细胞培养液，每孔加入200μl的细胞裂解液，用细胞刮将细胞刮至一侧，移液枪吸入已做好标记的ep管中；细胞破碎仪使细胞完全破碎；12000r/min高速离心机离心10min，取上清液，bca法测量蛋白浓度，蛋白经10％sds-page分离胶和5％sds-page浓缩胶分离后转移至pvdf膜，用300ma恒流转膜；3％的脱脂牛奶封闭液封闭pvdf膜1h，将pvdf膜孵育一抗β-act...
【专利技术属性】
技术研发人员：黎丽群，谢胜，刘礼剑，谭金晶，黄晓燕，罗贞艺，
申请(专利权)人：广西中医药大学第一附属医院广西中医医院，
类型：发明
国别省市：
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