【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学，特别涉及一种间质细胞自噬模型的建立方法。
技术介绍
1、gerd是指胃内容物反流至食管而引起反酸、烧心一系列症状和/或不适的疾病。该病全球患病率约为13.98％，并呈上升趋势，且容易反复，可增加食管癌、间质性肺炎等多种疾病的发病风险，严重危害患者的身心健康。因此，该病仍是目前行业重点关注的公共卫生问题之一。大量证据表明，胃食管动力障碍是gerd发病主要原因之一。作为特殊的消化道起搏器细胞，cajal间质细胞(interstitial cells of cajal，iccs)启动有节奏的生物电慢波触发消化道收缩与蠕动，以维持消化道正常运动功能。iccs功能缺失是引起消化道动力障碍而致病的主要原因。自噬是一种依赖于溶酶体自行降解细胞内成分的分解代谢过程。生理情况下，细胞自噬可将损伤的细胞器和细胞进行清理，维持机体的稳态。当自噬过度时，可破坏细胞结构，导致细胞功能缺失。课题组前期动物实验已证实，胃食管iccs自噬是引发gerd的关键病理机制。食管iccs自噬模型是研究gerd病理分子机制和药物作用机理的一种重要手段。现有技...
【技术保护点】
1.一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，原代分离与培养具体包括：在无菌条件下取出食管，置于含双抗的PBS液中，剥除外膜，去除黏膜及黏膜下层，得肌层，将肌层剪成1-2mm3小块，自然沉降弃上清，加入0.1％Ⅱ型胶原酶消化液，37℃水浴锅消化30min，吸出的上清酶液置于完全培养基中4℃保存，加入新的消化液，37℃水浴箱消化30min，将第二次消化后的组织悬液与前面的消化液混匀，过100目细胞筛，收集滤液300g，5min得细胞沉淀，PBS洗一遍后加入完全培养基重悬后铺板...
【技术特征摘要】
1.一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，原代分离与培养具体包括：在无菌条件下取出食管，置于含双抗的pbs液中，剥除外膜，去除黏膜及黏膜下层，得肌层，将肌层剪成1-2mm3小块，自然沉降弃上清，加入0.1％ⅱ型胶原酶消化液，37℃水浴锅消化30min，吸出的上清酶液置于完全培养基中4℃保存，加入新的消化液，37℃水浴箱消化30min，将第二次消化后的组织悬液与前面的消化液混匀，过100目细胞筛，收集滤液300g，5min得细胞沉淀，pbs洗一遍后加入完全培养基重悬后铺板，置37℃、5％co2培养箱培养，此后每2～3d换液一次，倒置显微镜下观察细胞形态变化。
3.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，免疫荧光鉴定具体包括：在培养板中将已爬好细胞的培养皿用pbs浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定15min，pbs浸洗培养皿3次，每次3min；pbs浸洗培养皿3次，每次5min，用移液枪吸干培养皿内的pbs，在培养皿内滴加5％bsa，37℃封闭30min；用移液枪吸干培养皿内的封闭液，不洗，每个培养皿滴加足够量一抗cd117，4℃冰箱过夜，滴加荧光二抗cy3，37℃孵育30min，pbs充分淋洗，用移液枪吸干培养皿内的pbs，在培养皿内滴加5％bsa，37℃封闭30min，滴加dapi避光孵育3min，对标本进行染核，用pbs冲洗，置于荧光显微镜下观察并采集图像。
4.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，活性检测具体包括：各组iccs分别加入0μm、25μm、50μm、75μm、100μm浓度的脱氧胆酸诱导3h后，将待测的96孔板细胞换成相同的培养基，每孔100ul，每孔加入10ulcck8试剂，置于培养箱中孵育2h，酶标仪在450nm波长处检测每孔的吸光值。
5.根据权利要求1所述一种间质细胞自噬模型的建立方法，其特征在于，蛋白相对表达水平检测具体包括：iccs经不同浓度脱氧胆酸诱导3h后，pbs洗涤3次，每次5min，弃掉培养皿中细胞培养液，每孔加入200μl的细胞裂解液，用细胞刮将细胞刮至一侧，移液枪吸入已做好标记的ep管中；细胞破碎仪使细胞完全破碎；12000r/min高速离心机离心10min，取上清液，bca法测量蛋白浓度，蛋白经10％sds-page分离胶和5％sds-page浓缩胶分离后转移至pvdf膜，用300ma恒流转膜；3％的脱脂牛奶封闭液封闭pvdf膜1h，将pvdf膜孵育一抗β-act...
【专利技术属性】
技术研发人员：黎丽群，谢胜，刘礼剑，谭金晶，黄晓燕，罗贞艺，
申请(专利权)人：广西中医药大学第一附属医院广西中医医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。