本发明专利技术公开了一种决定仔猪Ｆ４ａｃ腹泻易感性／抗性的ＭＵＣ１３基因及其在种猪遗传改良中的应用，它是利用大规模白色杜洛克×二花脸资源群体和１５个中外猪种的远缘群体，通过全基因组扫描连锁定位、目的区域高密度ＳＮＰ多点连锁精细定位、断点重组分析、基于连锁不平衡的远缘群体关联性分析、最后锁定了编码ＥＴＥＣ?Ｆ４ａｃ受体的目的基因－ＭＵＣ１３基因，并分离克隆了ＭＵＣ１３基因。在ＭＵＣ１３基因中鉴别到５个关键性突变位点。这五个突变位点在来自５个省份核心群的１４４头纯种杜、长、大仔猪中与ＥＴＥＣ?Ｆ４ａｃ体外黏附表型基本共分离，最强相关的标记判定抗性／易感个体的准确性达９７％（Ｐ＝１．５９×１０－２１）。本发明专利技术为种猪ＥＴＥＣ?Ｆ４ａｃ腹泻病的抗病育种提供了一种新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物遗传育种领域，具体涉及一个决定仔猪ETEC F4ac腹泻易感性/ 抗性的MUC13基因及其在种猪遗传改良中的应用。
技术介绍
仔猪腹泻是养猪生产中的常见传染病，给世界养猪业造成了巨大经济损失。产肠 毒素大肠杆菌F4(Enterotoxigenic Escherichia coli F4，ETEC F4)是引发新生和断奶前 仔猪腹泻病的最主要致病菌。以我国和丹麦为例，分别有约35%和40%的仔猪腹泻病是因 ETEC F4侵染而引起的。在我国，其致死率在10%-30%之间，在个别地方甚至比这个比例 更高，导致养猪出栏率、商品猪质量严重下降，经济效益受损。ETEC F4的致病性取决于其是否与猪小肠上皮细胞表面刷状缘的受体特异性结 合。这种结合发生后，ETEC F4大量繁殖产生肠毒素，致使肠上皮细胞分泌功能亢进，大量水 和电解质进入肠腔，造成肠腔中大量液体积蓄，超过了肠壁重吸收能力而引起腹泻。因此， 仔猪小肠上皮细胞有无ETECF4受体是仔猪被ETEC F4感染时是否发病的关键。无受体猪 表现为抵抗型，有受体猪则表现为易感型。分离和鉴别猪ETEC F4受体基因及其抗性位点 因而成为猪ETEC F4腹泻抗病育种的关键。已有的研究表明猪ETEC F4受体是单基因控制的，呈显隐性遗传模式。携带显性 基因S的猪对ETEC F4的粘附易感，隐性基因s纯合子猪则表现为抵抗型。常见西方商业 猪种中，如大白、长白和杜洛克，均有一定比例的易感个体。ETEC易感性可以通过小肠刷状 缘的体外黏附实验来判定，黏附的个体表现为易感，不黏附的个体表现为抵抗。ETEC F4根 据免疫学特征分为ab，ac和ad三种亚型，其中F4ac在西方猪群中是最主要的致病菌。因 而F4ac受体基因的定位和鉴别得到了国内外多个研究小组的重视。1995年，瑞典Leif Andersson小组利用欧洲野猪X大白猪资源家系群体为材 料，经过三代系谱的连锁分析，首次将ETEC F4ac受体定位于13号染色体，与Tf基因紧密 连锁，并发现F4ab和F4ac受体位点紧密连锁，认为这两个受体是由同一受体控制的。2002 年，瑞士 Peter Vogeli小组以大白猪和大白X长白三代家系为材料，利用13号染色体更 多的微卫星标记信息，将ETEC F4ac受体进一步定位于S0068和Swl030之间，与其中的 S0075和Sw225高度连锁(0 = 0. 00)。这一结果在1年后瑞典LeifAndersson小组和丹麦 Jorgensen小组联合开展的基因定位研究中得到了验证，他们还利用fish和辐射杂种细胞 克隆板技术揭示ETEC F4ac受体位于13号染色体q41区(SSC13q41)，分别与人3号染色体 的q28_29和q21区同源。2009年，瑞典LeifAndersson小组、丹麦J0rgensen小组和瑞士 Peter Vogeli小组联合开展的精细定位将ETEC F4ac受体基因进一步缩小至SSC13q41的 SW207与S0075之间。并提出该受体基因最有可能位于Sw207与MUC4之间的14Mb区域。鉴别SSC13q41区域的位置候选基因是当前ETEC F4ac受体研究的重点。大量的 免疫生化特性研究表明，黏蛋白型唾液糖蛋白(IMTGP)，74kDa的转铁蛋白(GV74)和小肠中 性糖鞘H(mLad)符合ETEC F4ac受体的理化特征，其中黏蛋白型唾液糖蛋白与F4ab和F4ac结合，但不与F4ad结合，且该糖蛋白的存在与新生仔猪对ETEC F4ab或F4ac的敏感性高度 相关，因而成为ETEC F4ac受体候选基因选择的重要依据。国内外研究小组在获得了 ETEC F4ac受体基因初步的染色体定位信息后，选择了黏附素糖蛋白编码基因(MUC基因家族)和 转铁蛋白受体基因(TFRC)进行了研究，瑞士 Peter Vogeli小组对TFRC、B3GnT5、B4GALT4 和B4GALT4等4个基因进行了研究，但没有发现与F4ac黏附表型显著相关的候选基因和标 记；丹麦J0rgensen小组在欧洲野猪x大白猪资源家系群体中，发现了 Mucin 4基因内含 子7的一个SNP标记与ETEC F4ac的黏附表型共分离，由此申请了一项国际专利技术专利。申请 人就该位点的影响效应在自身构建的白色杜洛克X 二花脸资源家系中开展了研究，发现 该标记在始祖动物中没有多态性，而该资源家系的&个体中有着充分分离的ETEC F4ac的 黏附表型，这表明该SNP标记只是与ETEC F4ac受体基因因果突变(causative mutation) 呈一定连锁不平衡的分子标记，不能解释所有群体的ETEC F4ac受体遗传基础。因此，尽管 国内外其他研究小组在ETEC F4ac受体基因鉴别方面取得了一定的进展，但仍未有重大的 突破，迄今没有鉴别到真正的ETEC F4ac受体基因及其关键变异位点。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一个决定新生和断奶前仔猪ETEC F4ac腹泻易感性 /抗性的MUC13基因及其关键标记位点；通过现代分子生物学技术检测该基因关键标记位 点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群新生和 断奶前仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。本专利技术的第二个目的是决定仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的MUC13基因关键标记 在种猪抗腹泻病性状遗传改良中的应用。本专利技术的第一个目的是这样实现的1、实验动物与易感/抗性表型判定1.1实验动物本专利技术用于目的基因定位的家系动物均来自申请人所构建的白色杜洛克X 二花 脸猪资源家系群体。该资源家系以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪为祖代繁殖& 代，选59头&母猪与9头&公猪自交产生F2代，在此基础上再选择62头F2公猪149头F2 母猪自交产生&代个体。每个资源家系F2/F3群体个体均在240士3日龄屠宰。本专利技术所使用的用于目的基因精细定位的远缘群体为292头纯种仔猪，其中代表 我国6个生态类型(包括华南、华中、华北、江海、西南、高原型等)的12个地方猪种(含二 花脸、金华猪、姜曲海猪、沙子岭猪、玉山黑猪、杭猪、通城猪、蓝塘猪、巴马香猪、莱芜猪、荣 昌猪、藏猪)148头，每个猪种选取至少3个父系家系，每个家系选择3-4个6-8周龄个体； 另外从5个不同省份大型商业种猪场购买144头杜洛克、长白、大白猪种，每个猪种同样选 取至少3个父系家系，每个家系选择3-4个6-8周龄个体。1.2易感/抗性表型判定猪只屠宰后，取小肠空肠部分，提取小肠上皮细胞刷状缘，利用E. coliF4ac菌株 黏附猪小肠上皮细胞刷状缘，通过相差显微镜检测细菌的黏附结果。每个样品检测20个以 上的刷状缘，若有10%以上的刷状缘上至少有2个细菌黏附，判该样品为黏附型，若至少有 2个细菌黏附的刷状缘不到10%，但有1-2个细菌黏附的刷状缘多于10%，判该样品为弱黏附型，否则判为不黏附型。黏附效果图如附图1所示。2、全基因组扫描初步定位ETEC F4ac受体基因本专利技术首先选用覆盖19条染色体的来自美国肉畜中心(MARC)网站公开的151个 微卫星标记，在申请人所构建的白色杜洛克X 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个决定仔猪Ｆ４ａｃ腹泻易感性／抗性的ＭＵＣ１３基因，其特征在于：其ｃＤＮＡ序列特征如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １。
【技术特征摘要】
一个决定仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的MUC13基因，其特征在于其cDNA序列特征如序列表SEQ ID NO 1。2.如权利要求1所述的决定仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的MUC13基因，其特征在于 其DNA序列特征为如序列表SEQ ID NO 2。3.如权利要求1所述的决定仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的MUC13基因，其特征在于 其编码蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 3。4.如权利要求2所述的决定仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的MUC13基因，其特征在于 其序列表SEQ ID NO 2的第32813bp处为C32813-32813T的碱基突变；第37618bp处为 C37618-37618T的碱基突变；第4278...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄路生，任军，晏学明，艾华水，张志燕，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]
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