用于真核表达系统的可选择标志物技术方案

技术编号：41509320 阅读：25 留言：0更新日期：2024-05-30 14:48

本文公开了新型可选择标志物及其用途。具体地，本文提供了编码来源于鸭嘴兽、龟、大鼠、负鼠、袋熊或斑胸草雀的谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列作为可选择标志物用于鉴别具有高转录活性的基因组基因座或者具有目的蛋白的高生产能力的宿主细胞，和/或允许加快表达目的蛋白的细胞分离的用途。还包括相关筛选方法、生产方法和表达系统。

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】

1.本专利技术涉及分子生物学和细胞生物学。本文所提供的包括用于重组蛋白产生的可选择标志物和相关使用方法。

技术介绍

0、2.
技术介绍

1、可选择标志物在重组蛋白产生中是常用的。当产生表达重组蛋白的克隆时，通常用编码目的蛋白和可选择标志物两者的dna载体转染宿主细胞。可选择标志物允许选择具有表达载体的细胞克隆以及高产克隆。谷氨酰胺合成酶(gs)已在真核细胞，如中国仓鼠卵巢(cho)细胞中的重组蛋白产生中广泛用作可选择标志物。目前在gs系统中所使用的几乎所有的可选择标志物是中国仓鼠(cricetulus griseus)-来源的gs，其具有相对低的选择效率和产率。更有效果和效率的生产方法是支持创新生物制品和生物类似物发展所必需的，其需要具有所期望的质量属性的高产细胞系。因此，对于在细胞系产生过程中，特别是在高产克隆细胞系的选择步骤中具有改善的效果与效率的表达系统的需求仍未满足且是急迫的。本文所提供的载体、细胞、表达系统解决了这种需求并且提供了相关优势。

2、3.
技术实现思路

3、本文提供了编码谷氨酰胺合成酶(gs)的核苷酸序列作为可选择标志物的用途，其中gs是鸭嘴兽gs、龟gs、大鼠gs、负鼠gs、袋熊gs或者斑胸草雀gs。

4、在本文所提供的用途的一些实施方式中，gs是来源于鸭嘴兽科(ornithorhynchidae)的鸭嘴兽gs。在一些实施方式中，gs具有与seq idno：1具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施

5、在本文所提供的用途的一些实施方式中，gs是来源于龟科(testudinidae)的龟gs。在一些实施方式中，gs具有与seq id no：2具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，与野生型龟gs相比，gs具有降低的活性。在一些实施方式中，gs具有seq id no：2所示的氨基酸序列。

6、在本文所提供的用途的一些实施方式中，gs是来源于鼠科真鼠分支(eumuroida)的大鼠gs。在一些实施方式中，gs具有与seq id no：3具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，与野生型大鼠gs相比，gs具有降低的活性。在一些实施方式中，gs具有seq id no：3所示的氨基酸序列。

7、在本文所提供的用途的一些实施方式中，gs是来源于负鼠科(didelphidae)的负鼠gs。在一些实施方式中，gs具有与seq id no：13具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，与野生型负鼠gs相比，gs具有降低的活性。在一些实施方式中，gs具有seq id no：13所示的氨基酸序列。

8、在本文所提供的用途的一些实施方式中，gs是来源于袋熊科(vombatidae)的袋熊gs。在一些实施方式中，gs具有与seq id no：14具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，与野生型袋熊gs相比，gs具有降低的活性。在一些实施方式中，gs具有seq id no：14所示的氨基酸序列。

9、在本文所提供的用途的一些实施方式中，gs是来源于蜡嘴雀科(estrildidae)的斑胸草雀gs。在一些实施方式中，gs是斑胸草雀gs，其具有与seq id no：15具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，与野生型斑胸草雀gs相比，gs具有降低的活性。在一些实施方式中，gs具有seq id no：15所示的氨基酸序列。

10、在本文所提供的用途的一些实施方式中，本文所提供的gs的氨基酸序列包含在选自下列的位置具有氨基酸替换的seq id no：4：a2、n10、g12、q15、m16、m18、s19、e24、v26、q27、a28、v33、g37、g39、c49、e50、c53、v54、e55、e56、f68、s72、s80、v82、m84、k91、e92、v97、f98、q106、k107、p108、t111、t116、k118、s125、n126、q127、h128、l140、d152、l160、r172、m176、v188、t191、y194、v197、k198、h199、a200、i206、r213、v220、a221、k230、v234、i235、a236、t237、s240、p244、t258、t260、n265、k268、h269、k271、e275、k276、r282、a297、h304、k305、n308、n310、d311、d318、s320、t328、q331、e332、a339、c341、f349、t352、i355、v356、n362、t364、d366、q367和q370。在一些实施方式中，本文所提供的gs的氨基酸序列包含在选自下列的位置具有氨基酸替换的seqid no：4：n10、g12、s19、v33、c49、c53、v54、e55、e56、f68、s72、s80、v82、m84、k91、e92、f98、q106、h128、l140、d152、l160、r172、m176、t191、y194、k198、h199、r213、v220、k230、a236、t237、s240、t260、k271、k276、r282、h304、k305、d311、d318、s320、t328、a339、c341、f349、i355、v356、q367和q370。

11、在本文所提供的用途的一些实施方式中，本文所提供的gs的氨基酸序列包含在选自下列的位置具有氨基酸替换的seq id no：4：s19、s72、s80、e92、q106、d152、l160、r172、m176、y194、k198、h199、k230、s240、t260、k271、r282、k305、d318、a339、c341和q367。在一些实施方式中，gs的氨基酸序列包含在选自下列的位置具有至少3、至少5、至少10、至少15或至少20个氨基酸替换的seq id no：4：s19、s72、s80、e92、q106、d152、l160、r172、m176、y194、k198、h199、k230、s240、t260、k271、r282、k305、d318、a339、c341和q367。

12、本文还提供了编码gs的核苷酸序列作为可选择标志物的用途，其中gs包含来自鸭嘴兽gs、龟gs、大鼠gs、负鼠gs、袋熊gs或者斑胸草雀gs的催化结构域。

13、在一些实施方式中，gs包含来自鸭嘴兽gs的催化结构域，其具有与seq id no：本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.编码谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列作为可选择标志物的用途，其中所述GS是鸭嘴兽GS、龟GS、大鼠GS、负鼠GS、袋熊GS或斑胸草雀GS。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS是来源于鸭嘴兽科(Ornithorhynchidae)的鸭嘴兽GS。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述GS具有与SEQ ID NO：1具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其中与野生型鸭嘴兽GS相比，所述GS具有降低的活性。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS是来源于龟科(Testudinidae)的龟GS。

7.根据权利要求1或6所述的用途，其中所述GS具有与SEQ ID NO：2具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其中与野

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS是来源于鼠科真鼠分支(Eumuroida)的大鼠GS。

11.根据权利要求1或10所述的用途，其中所述GS具有与SEQ ID NO：3具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其中与野生型大鼠GS相比，所述GS具有降低的活性。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS是来源于负鼠科(Didelphidae)的负鼠GS。

15.根据权利要求1或14所述的用途，其中所述GS具有与SEQ ID NO：13具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

16.根据权利要求14或15所述的用途，其中与野生型负鼠GS相比，所述GS具有降低的活性。

17.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。

18.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS是来源于袋熊科(Vombatidae)的袋熊GS。

19.根据权利要求1或18所述的用途，其中所述GS具有与SEQ ID NO：14具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

20.根据权利要求18或19所述的用途，其中与野生型袋熊GS相比，所述GS具有降低的活性。

21.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

22.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS是来源于蜡嘴雀科(Estrildidae)的斑胸草雀GS。

23.根据权利要求1或22所述的用途，其中所述GS是斑胸草雀GS，其具有与SEQ ID NO：15具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

24.根据权利要求22或23所述的用途，其中与野生型斑胸草雀GS相比，所述GS具有降低的活性。

25.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。

26.根据权利要求1所述的用途，其中所述GS的氨基酸序列包含在选自下列的位置具有氨基酸替换的SEQ ID NO：4：A2、N10、G12、Q15、M16、M18、S19、E24、V26、Q27、A28、V33、G37、G39、C49、E50、C53、V54、E55、E56、F68、S72、S80、V82、M84、K91、E92、V97、F98、Q106、K107、P108、T111、T116、K118、S125、N126、Q127、H128、L140、D152、L160、R172、M176、V188、T191、Y194、V197、K198、H199、A200、I206、R213、V220、A221、K230、V234、I235、A236、T237、S240、P244、T258、T260、N265、K268、H269、K271、E275、K276、R282、A297、H304、K305、N...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

1.编码谷氨酰胺合成酶(gs)的核苷酸序列作为可选择标志物的用途，其中所述gs是鸭嘴兽gs、龟gs、大鼠gs、负鼠gs、袋熊gs或斑胸草雀gs。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs是来源于鸭嘴兽科(ornithorhynchidae)的鸭嘴兽gs。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述gs具有与seq id no：1具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其中与野生型鸭嘴兽gs相比，所述gs具有降低的活性。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs具有seq id no：1所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs是来源于龟科(testudinidae)的龟gs。

7.根据权利要求1或6所述的用途，其中所述gs具有与seq id no：2具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其中与野生型龟gs相比，所述gs具有降低的活性。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs具有seq id no：2所示的氨基酸序列。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs是来源于鼠科真鼠分支(eumuroida)的大鼠gs。

11.根据权利要求1或10所述的用途，其中所述gs具有与seq id no：3具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其中与野生型大鼠gs相比，所述gs具有降低的活性。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs具有seq id no：3所示的氨基酸序列。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs是来源于负鼠科(didelphidae)的负鼠gs。

15.根据权利要求1或14所述的用途，其中所述gs具有与seq id no：13具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

16.根据权利要求14或15所述的用途，其中与野生型负鼠gs相比，所述gs具有降低的活性。

17.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs具有seq id no：13所示的氨基酸序列。

18.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs是来源于袋熊科(vombatidae)的袋熊gs。

19.根据权利要求1或18所述的用途，其中所述gs具有与seq id no：14具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

20.根据权利要求18或19所述的用途，其中与野生型袋熊gs相比，所述gs具有降低的活性。

21.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs具有seq id no：14所示的氨基酸序列。

22.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs是来源于蜡嘴雀科(estrildidae)的斑胸草雀gs。

23.根据权利要求1或22所述的用途，其中所述gs是斑胸草雀gs，其具有与seq id no：15具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

24.根据权利要求22或23所述的用途，其中与野生型斑胸草雀gs相比，所述gs具有降低的活性。

25.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs具有seq id no：15所示的氨基酸序列。

26.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs的氨基酸序列包含在选自下列的位置具有氨基酸替换的seq id no：4：a2、n10、g12、q15、m16、m18、s19、e24、v26、q27、a28、v33、g37、g39、c49、e50、c53、v54、e55、e56、f68、s72、s80、v82、m84、k91、e92、v97、f98、q106、k107、p108、t111、t116、k118、s125、n126、q127、h128、l140、d152、l160、r172、m176、v188、t191、y194、v197、k198、h199、a200、i206、r213、v220、a221、k230、v234、i235、a236、t237、s240、p244、t258、t260、n265、k268、h269、k271、e275、k276、r282、a297、h304、k305、n308、n310、d311、d318、s320、t328、q331、e332、a339、c341、f349、t352、i355、v356、n362、t364、d366、q367和q370。

27.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs的氨基酸序列包含在选自下列的位置具有氨基酸替换的seq id no：4：n10、g12、s19、v33、c49、c53、v54、e55、e56、f68、s72、s80、v82、m84、k91、e92、f98、q106、h128、l140、d152、l160、r172、m176、t191、y194、k198、h199、r213、v220、k230、a236、t237、s240、t260、k271、k276、r282、h304、k305、d311、d318、s320、t328、a339、c341、f349、i355、v356、q367和q370。

28.根据权利要求1所述的用途，其中所述gs的氨基酸序列包含在选自下列的位置具有氨基酸替换的seq id no：4：s19、s72、s80、e92、q106、d152、l160、r172、m176、y194、k198、h199、k230、s240、t260、k271、r282、k305、d318、a339、c341和q367。

29.根据权利要求28所述的用途，其中所述gs的氨基酸序列包含在选自下列的位置具有至少3、至少5、至少10、至少15或至少20个氨基酸替换的seq id no：4：s19、s72、s80、e92、q106、d152、l160、r172、m176、y194、k198、h199、k230、s240、t260、k271、r282、k305、d318、a339、c341和q367。

30.编码gs的核苷酸序列作为可选择标志物的用途，其中所述gs包含来自鸭嘴兽gs、龟gs、大鼠gs、负鼠gs、袋熊gs或斑胸草雀gs的催化结构域。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述gs包含来自鸭嘴兽gs的催化结构域，其具有与seq id no：1具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述催化结构域具有与seq id no：1的氨基酸110-359具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

33.根据权利要求30所述的用途，其中所述gs包含来自龟gs的催化结构域，其具有与seq id no：2具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述催化结构域具有与seq id no：2的氨基酸110-359具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

35.根据权利要求30所述的用途，其中所述gs包含来自大鼠gs的催化结构域，其具有与seq id no：3具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

36.根据权利要求35所述的用途，其中所述催化结构域具有与seq id no：3的氨基酸113-373具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

37.根据权利要求30所述的用途，其中所述gs包含来自负鼠gs的催化结构域，其具有与seq id no：13具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

38.根据权利要求37所述的用途，其中所述催化结构域具有与seq id no：13的氨基酸110-359具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

39.根据权利要求30所述的用途，其中所述gs包含来自袋熊gs的催化结构域，其具有与seq id no：14具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

40.根据权利要求39所述的用途，其中所述催化结构域具有与seq id no：14的氨基酸110-359具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

41.根据权利要求30所述的用途，其中所述gs包含来自斑胸草雀gs的催化结构域，其具有与seq id no：15具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

42.根据权利要求41所述的用途，其中所述催化结构域具有与seq id no：15的氨基酸163-412具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

43.根据权利要求30所述的用途，其中所述gs具有选自下列的氨基酸序列：seq id no：19、21、23、25、27、29和31-60。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的用途，其中所述gs编码核苷酸序列可操作地连接至mrna去稳定元件。

45.根据权利要求1至43中任一项所述的用途，其中所述gs包含降解决定子。

46.根据权利要求45所述的用途，其中所述降解决定子具有选自seq id no：61-63的氨基酸序列。

47.根据权利要求46所述的用途，其中所述gs具有选自seq id no：64-84的氨基酸序列。

48.根据权利要求1至47中任一项所述的用途，其用于鉴别具有高转录活性的基因组基因座。

49.根据权利要求1至47中任一项所述的用途，其用于鉴别能够产生目的蛋白(poi)的宿主细胞。

50.根据权利要求1至47中任一项所述的用途，其用于poi的重组生产。

51.根据权利要求50所述的用途，其用于哺乳动物细胞中的重组蛋白质生产。

52.根据权利要求51所述的用途，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。

53.根据权利要求49至52中任一项所述的用途，其中所述poi选自抗体、酶、可溶性蛋白、分泌蛋白、膜蛋白和融合蛋白。

54.适合于重组蛋白生产或基因组整合的脱氧核糖核酸(dna)载体，其包含编码gs的核苷酸序列(gs-编码序列)，其中所述gs是鸭嘴兽gs、龟gs、大鼠gs、负鼠gs、袋熊gs或者斑胸草雀gs。

55.根据权利要求54所述的载体，其中所述gs是来源于鸭嘴兽科(ornithorhynchidae)的鸭嘴兽gs。

56.根据权利要求54或55所述的载体，其中所述gs具有与seq id no：1具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

57.根据权利要求55或56所述的载体，其中与野生型鸭嘴兽gs相比，所述gs具有降低的活性。

58.根据权利要求54所述的载体，其中所述gs具有seq id no：1所示的氨基酸序列。

59.根据权利要求55至58中任一项所述的载体，其中所述gs-编码序列与seq id no：5具有至少80％的同一性。

60.根据权利要求54所述的载体，其中所述gs是来源于龟科(testudinidae)的龟gs。

61.根据权利要求54或60所述的载体，其中所述gs具有与seq id no：2具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

62.根据权利要求60或61所述的载体，其中与野生型龟gs相比，所述gs具有降低的活性。

63.根据权利要求54所述的载体，其中所述gs具有seq id no：2所示的氨基酸序列。

64.根据权利要求60至63中任一项所述的载体，其中所述gs-编码序列与seq id no：6具有至少80％的同一性。

65.根据权利要求54所述的载体，其中所述gs是来源于鼠科真鼠分支(eumuroida)的大鼠gs。

66.根据权利要求54或65所述的载体，其中所述gs具有与seq id no：3具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。

67.根据权利要求65或66所述的载体，其中与野生型大鼠gs相比，所述gs具有降低的活性。

68.根据权利要求54所述的载体，其中所述gs具有seq id no：3所示的氨基酸序列。

69.根据权利要求65至68中任一项所述的载体，其中所述gs-编码序列与seq id no：7具有至少80％的同一性。

70.根据权利要求54所述的载体，其中所述gs是来源于负鼠科(didelphidae)的负鼠gs。

71.根据权利要求54或70所述的载体，其中所述gs具有与seq id no：13具有至少90％、至少92％、至少95％、...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵威，陈经公，许滢，龙玙，张静，刘行行，刘锦荣，伍维，郝卫东，陈建新，
申请(专利权)人：上海臻格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：

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