二价手足口病灭活疫苗制造技术

本发明专利技术为二价手足口病灭活疫苗。技术领域：本发明专利技术属于一种新型病毒性灭活疫苗。用途：该疫苗用于预防手足口病。主要技术：毒种：ＥＶ７１和ＣＡ１６病毒均分离自手足口病患者咽试子。分离及生产用细胞：自美国ＡＴＣＣ疫苗制备方法：用反应器、转瓶或细胞工厂培养Ｖｅｒｏ细胞，成片后感染ＥＶ７１或者ＣＡ１６病毒，于３５℃培养４８－９６小时后收获病毒，经０．６５－０．２２微米滤膜多级过滤、１００ＭＷ超滤浓缩、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ?６?Ｆａｓｔ?Ｆｌｏｗ层析、ＤＥＡＥ?Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ?ＦＦ层析、１∶２０００甲醛于３７℃灭活１２天，分别制成单价灭活原液；将两种灭活原液以１∶１体积比混合，加入人白保护剂后即为双价手足口病灭活疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种新型预防用病毒性灭活疫苗。
技术介绍
手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)是一种主要发生于儿童的病毒性皮肤病，多发生于婴幼儿，成人也偶见发生，又名发疹性水泡性口腔炎，具有很强的传染性，常爆发流行，已有数十个国家和地区报告发生和流行。亚太地区HFMD流行伴有较高的死亡率。有报道HFMD感染部分患儿有不同程度的心肌损害。台湾1998 2000年两次爆发HFMD流行，死亡78例。该病以手、足和口腔粘膜疱疹或破溃成溃疡为主要临床症状，并可发生严重的并发症，如并发无菌性脑膜炎、脑炎及瘫痪。目前HFMD极强的传染性越来越被临床医师所重视，且HFMD发生于夏季，易继发皮肤感染，故积极治疗，防止继发感染，切断传播途径、尤其是预防爆发流行显得尤为重要。与大部分仅由一种病原体引起的传染病(如乙肝、麻疹)不同，手足口病由多种病毒感染引起，但绝大部分都是由科萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A 16，CA16)和肠道病毒 7I 型(Enteroviruse EV71)引起。本专利技术的目的就是研制一种可以同时预防CA16和EV71病毒引起的手足口病。
技术实现思路
分离手足口病病原体EV71病毒和CA16病毒，经过纯化、灭活、抗原性及免疫原性测定，确定了将二者联合制成灭活疫苗的方法，用于预防手足口病流行。用反应器、转瓶或细胞工厂培养Vero细胞，成片后感染EV71或者CA16病毒， 于35°C培养48-96小时后收获病毒，经0. 65-0. 22微米滤膜多级过滤、100丽超滤浓缩、 Sepharose 6 Fast Flow 层析、DEAE Sepharose FF 层析、1 2000 甲酸于 37°C灭活 12 天， 分别制成单价灭活原液；将两种灭活原液以1 1体积比混合，加入人白保护剂后即为二联手足口病灭活疫苗。具体实施方式1. EV71和CA16病毒均分离自手足口病患者咽试子。2.病毒分离和疫苗制备用细胞为非洲绿猴肾传代细胞(Vero)，购自美国ATCC。3.分别制备EV71和CA16的病毒种子批系统将分离的原始毒种在Vero细胞上传代扩增，制备EV71和CA16病毒主种子批和工作种子批。4.病毒种子批鉴定按照2005版《中国药典》二部中生产人用疫苗用毒种的要求对毒种进行全面鉴定，确定无外援因子污染，无菌、无支原体污染，用单抗对两种病毒进行生物学鉴定。对病毒滴度、免疫原性进行检查。5.建立细胞库将ATCC购来的原始细胞通过传代扩增，分别冻存主细胞库和工作细胞库。并按照2005版《中国药典》二部中传代细胞作为人用疫苗的细胞基质的质量要求进行全检。6.复苏工作库细胞并传代扩增至反应器规模或细胞工厂规模或3L细胞培养瓶。7.细胞成片后(80%成片)，感染工作种子批EV71或CA16病毒，于35-37°C培养 48-96小时后收获细胞培养上清液。8.用0. 65-0. 22微米滤膜进行多级过滤，去除细胞碎片。9.用100MW截留分子量的超滤膜进行超滤浓缩50-100倍。10.用S^harose 6 Fast Flow进行分子筛层析，收集第一峰。11.用DEAE-S印arose FF进行阴离子交换层析，收集流穿峰。12.纯化病毒液中加入1 2000-1 4000的福尔马林摇勻，置33_37°C作用6-12 天。13.加入稳定剂，即为单价灭活原液。EV71和CA16的单价原液应该分别制备，不可同时在同一批细胞上制备。14.用微量滴定法测定病毒收获液的病毒滴度，病毒滴度应不低于7.0 CCID50/ ml ο15.分别用EV71和CA16单抗包板，用双抗体夹心法测定各工艺步骤的抗原含量。16.用微量中和试验测定灭活抗原的免疫原性和保护性抗体产生水平。17.根据抗原测定结果和免疫原性测定结果，将两种单价灭活原液按照一定比例混合，制成半成品。18.分装成0.5ml/至，即为二联手足口病灭活疫苗。权利要求1.一种同时包含肠道病毒71型(EV71)和科萨奇病毒A组16型(CA16)的二联手足口病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤a)用反应器或细胞工厂或玻璃转瓶培养Vero细胞复苏工作库细胞并传代扩增至反应器规模或细胞工厂规模或3L细胞培养瓶。b)细胞成片后感染EV71或CA16病毒，于33-35°C培养48-96小时。c)收获培养上清液。d)通过多级过滤去除细胞碎片。e)超滤浓缩病毒悬液用100MW截留分子量的超滤膜进行超滤浓缩50-100倍。f)分子筛层析纯化病毒悬液。g)离子交换层析病毒悬液。h)通过灭活剂灭活病毒获得EV71或CA16单价灭活原液。i)混合EV71和CA16单价灭活原液配制半成品。 j)分装成0. 5ml/支，制成二联灭活疫苗。2.权利要求1的方法，其中EV71毒种和CA16毒种为中国境内分离的任何同型毒株。3.权利要求1的方法，反应器培养细胞所用的微载体为cytodexl。4.权利要求1的方法，分子筛层析所用介质为kpharose6 Fast Flow。5.权利要求1的方法，分子筛层析所用平衡液为PH6. 8-7. 6的磷酸盐缓冲溶液。6.权利要求1的方法，离子交换层析所用介质为DEAESepharose Fast Flow。7.权利要求1的方法，离子交换层析所用平衡液为pH6. 8-7. 6的磷酸盐缓冲溶液，洗脱液为含有0. 1-0. 5M氯化钠，PH为6. 8-7. 6的缓冲盐溶液。8.权利要求1的方法，其中灭活剂为福尔马林溶液，反应浓度为1 1000至1 4000。9.权利要求1的方法，其中灭活剂作用温度为35°C 37°C。10.权利要求1的方法，其中灭活剂作用时间为6 12天。11.权利要求1的方法，其中EV71和CA16单价灭活原液的混合比例包括任何体积比例。专利摘要本专利技术属于一种新型病毒性灭活疫苗。该疫苗用于预防手足口病。主要技术毒种EV71和CA16病毒均分离自手足口病患者咽试子。分离及生产用细胞自美国ATCC，疫苗制备方法用反应器、转瓶或细胞工厂培养Vero细胞，成片后感染EV71或者CA16病毒，于35℃培养48-96小时后收获病毒，经0.65-0.22微米滤膜多级过滤、100MW超滤浓缩、Sepharose 6 Fast Flow层析、DEAE Sepharose FF层析、1∶2000甲醛于37℃灭活12天，分别制成单价灭活原液；将两种灭活原液以1∶1体积比混合，加入人白保护剂后即为二联手足口病灭活疫苗。文档编号C12R1/93GKCN101780278 B发布类型授权 专利申请号CN 200910177426公开日2012年2月1日 申请日期2009年9月29日专利技术者石慧颖, 贾宝山 申请人:福尔生物制药股份有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2),本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时包含肠道病毒７１型（ＥＶ７１）和科萨奇病毒Ａ组１６型（ＣＡ１６）的二价手足口病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：ａ）用反应器或细胞工厂或玻璃转瓶培养Ｖｅｒｏ细胞。ｂ）细胞成片后感染ＥＶ７１或ＣＡ１６病毒，于３３－３５℃培养。ｃ）收获培养上清液ｄ）通过多级过滤去除细胞碎片ｅ）超滤浓缩病毒悬液ｆ）分子筛层析纯化病毒悬液ｇ）离子交换层析病毒悬液ｈ）通过灭活剂灭活病毒获得ＥＶ７１或ＣＡ１６单价灭活原液ｉ）混合ＥＶ７１和ＣＡ１６单价灭活原液配制半成品ｊ）分装成０．５ｍｌ／支，制成双价灭活疫苗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾宝山，石慧颖，
申请(专利权)人：福尔生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]