【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药，具体涉及一种线粒体dna突变诱导释放药物的复合物、其制备方法及其用途。
技术介绍
1、癌症严重威胁人类的生命健康，由于肿瘤和正常组织之间具有不可区分的共同特征，因此在不影响正常细胞的情况下精确杀伤肿瘤细胞是一项极大的挑战。基因组的不稳定性和突变是癌症的重要特征，癌症基因组中的驱动突变直接或间接地为携带这些突变的恶性肿瘤带来了选择性生长优势。其中，特征性基因突变具有较高的稳定性和特异性，已成为理想的肿瘤特异性治疗靶点，为人类肿瘤精准治疗提供了基因型特异性方法。
2、目前现有技术中已经设计了一些智能策略，以肿瘤特异性基因突变为目标，以实现高度特异性肿瘤细胞损伤。聚类规则间隔短回文重复序列(crispr)系统作为一种广泛应用的基因编辑系统，在这方面取得了巨大的进展。例如，koo等人(selective disruptionof an oncogenic mutant allele by crispr/cas9induces efficient tumorregression.nucleic acids res 45,7897-7908,doi:10.1093/nar/gkx490(2017).)证明了使用cas9系统从野生型egfr等位基因中区分致癌突变体，并高精度地消除致癌突变egfr等位基因，以实现突变egfr介导的肺癌的精确治疗。kwon等人(precision targetingtumor cells using cancer-specific indel mutations with cris
3、线粒体dna(mtdna)是一种环状双链dna(dsdna)，每个细胞存在数百到数千个拷贝，控制着线粒体氧化磷酸化系统的生物生成。mtdna突变是肿瘤中最常见的遗传事件之一，与多种癌症类型的发展和转移相关，可直接影响代谢稳态。随着测序技术的发展，mtdna中的单碱基突变被认为是肿瘤发生发展的重要分子特征，可作为基因型特异性肿瘤治疗的理想靶点。此外，线粒体是细胞的能量工厂，执行与细胞代谢有关的各种功能，近年来已被用作肿瘤治疗的重要靶点。因此，靶向mtdna中的snvs，结合线粒体靶向药物释放，产生大量的dsbs有望实现更有效的杀伤肿瘤细胞。
4、为了将mtdna中的snvs转化为线粒体靶向药物释放的开关，需要引入新的分子识别和信号转换工具。cas12a是一种ii型crispr系统，具有高效的序列靶向结合和与工程crrna26的单碱基分辨率特异性。其由靶dna启动的单链dna(ssdna)的非特异性切割已广泛用于体外和体内核酸信息的识别和传感，这具有使线粒体dna响应性药物释放的潜力。
5、然而，线粒体是一种具有完备双层膜结构的细胞器，因此cas12a/crrna复合物的线粒体靶向传递具有一定的困难。此外，目前研究人员普遍认为cas12a在哺乳动物细胞中反式切割活性较弱，难以实现高效的剪切。可见，cas12a/crrna复合物的线粒体靶向传递及其在细胞内反切活性的有效激活成为cas12a系统控制细胞内药物释放的主要瓶颈。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺陷，本专利技术提供一种线粒体dna突变诱导释放药物的复合物、其制备方法及其用途。
2、一种线粒体dna突变诱导释放药物的复合物，它是由含有单链dna的杂化核酸纳米载体、含有dna黏性末端的bhq3淬灭的ce6光敏剂和cas12a/crrna复合物通过碱基互补配对构成的；
3、其中，所述bhq3淬灭的ce6光敏剂包括bhq3和ce6，所述bhq3和ce6上分别修饰有部分互补配对的单链dna；
4、所述cas12a/crrna复合物包括cas12a和用于识别肿瘤细胞线粒体dna单碱基突变位点的crrna；
5、所述杂化核酸纳米载体的单链dna包括用于靶向线粒体的细胞色素c核酸适体的dna序列、用于与所述bhq3淬灭的ce6光敏剂互补配对的dna序列和用于与cas12a/crrna复合物互补配对的dna序列。
6、优选的，所述杂化核酸纳米载体的单链dna是由seq id no.1所示核苷酸序列多次重复构成的。
7、优选的，所述杂化核酸纳米载体的单链dna是利用环状模板进行滚环扩增反应制备而成的，所述环状模板的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8、优选的，所述环状模板是将5’磷酸化模板1、模板2、引物1和引物2通过t4 dna连接酶环化得到；
9、其中，模板1的核苷酸序列如seq id no.3所示，模板2的核苷酸序列如seq idno.4所示，引物1的核苷酸序列如seq id no.5所示，引物2的核苷酸序列如seq id no.6所示。
10、优选的，所述杂化核酸纳米载体为以焦磷酸镁为内核的dna纳米花。
11、优选的，所述bhq3淬灭的ce6光敏剂包括部分互补配对的第一单链dna和第二单链dna，所述第一单链dna的5’端与ce6连接，所述第二单链dna的3’端与bhq3连接；
12、所述第一单链dna的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述第二单链dna的核苷酸序列如seq id no.8所示。
13、优选的，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.9所示。
14、优选的，包括如下步骤：
15、步骤1，通过t4 dna连接酶环化，制备环状模板；
16、步骤2，利用环状模板进行滚环扩增反应制备得到所述杂化核酸纳米载体；
17、步骤3，将5’端与ce6连接的第一单链dna和3’端与bhq3连接的第二单链dna复合，得到bhq3淬灭的ce6光敏剂；
18、步骤4，将cas12a和crrna复合，得到cas12a/crrna复合物；
19、步骤5，将杂化核酸纳米载体和bhq3淬灭的ce6光敏剂复合，得到dnf/ce6-q复合物，然后将dnf/ce6-q复合物与cas12a/crrna复合物进行复合，即得。
20、优选的，步骤2中，所述滚环扩增反应的反应体系为：20μl 1μm环状模板、4μl 10×phi 29dna聚合酶缓冲液、5μl dntp、1μl phi 29dna聚合酶和10μl depc处理水；反应的条件为：在36-38℃孵育2小时后，在65℃变性10分钟；
21、和/或，步骤3中，复合的反应体系为：3-5μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种线粒体DNA突变诱导释放药物的复合物，其特征在于：它是由含有单链DNA的杂化核酸纳米载体、含有带黏性末端的双链DNA的BHQ3淬灭的Ce6光敏剂和Cas12a/crRNA复合物通过DNA或者RNA的碱基互补配对构成的；
2.按照权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述杂化核酸纳米载体的单链DNA是由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列多次重复构成的。
3.按照权利要求2所述的复合物，其特征在于：所述杂化核酸纳米载体的单链DNA是利用环状模板进行滚环扩增反应制备而成的，所述环状模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.按照权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述杂化核酸纳米载体为以焦磷酸镁为内核的DNA纳米花。
5.按照权利要求1所述的复合物，其特征在于：含有带黏性末端的双链DNA的BHQ3淬灭的Ce6光敏剂包括部分互补配对的第一单链DNA和第二单链DNA，所述第一单链DNA的5’端与Ce6连接，所述第二单链DNA的3’端与BHQ3连接；
6.按照权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述crRNA的核苷酸
7.权利要求1-6任一项所述复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
9.权利要求1-6任一项所述复合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
10.一种用于治疗癌症的药物，其特征在于：它是以权利要求1-6任一项所述复合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的制剂。
...【技术特征摘要】
1.一种线粒体dna突变诱导释放药物的复合物，其特征在于：它是由含有单链dna的杂化核酸纳米载体、含有带黏性末端的双链dna的bhq3淬灭的ce6光敏剂和cas12a/crrna复合物通过dna或者rna的碱基互补配对构成的；
2.按照权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述杂化核酸纳米载体的单链dna是由seq id no.1所示核苷酸序列多次重复构成的。
3.按照权利要求2所述的复合物，其特征在于：所述杂化核酸纳米载体的单链dna是利用环状模板进行滚环扩增反应制备而成的，所述环状模板的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4.按照权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述杂化核酸纳米载体为以焦磷酸镁为内核的dna纳米花。
5.按照权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：张开翔，李亚楠，裴怡然，史进进，刘军杰，张振中，李景虹，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。