【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测方法，尤其是涉及一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法。
技术介绍
1、脂肪酸是人体必需的营养物质，是构成细胞膜、合成激素、维持神经系统功能等的重要组成部分。不同类型的脂肪酸对健康有不同影响，如饱和脂肪酸与心血管疾病风险增加相关，而omega-3脂肪酸则被认为对心脏健康有益，有助于降低心血管疾病风险；此外，omega-3脂肪酸也具有抗炎和调节免疫功能的作用。脂肪酸也是大脑的主要结构成分之一，与脑功能、认知能力和情绪调节密切相关。肠道微生物可以通过发酵膳食纤维等物质产生短链脂肪酸（如丙酸、丁酸和乳酸等），有些短链脂肪酸对人体的健康具有重要的作用。通过深入研究脂肪酸在不同健康领域的作用机制，可以为制定个性化膳食建议、预防和治疗相关疾病提供科学依据。
2、脂肪酸的定量检测对于脂肪酸的研究具有重要的意义，液相色谱-质谱联用法（lc-ms）是目前常用的定量检测脂肪酸的方法，例如，公开号为cn113138246a的专利中公开的一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法；公开号为cn109298115a的专利中公开的一种生物样品中多种代谢物定量检测方法及代谢芯片。但现有技术中的液质联用法可以定量的脂肪酸数量比较少，主要针对短链脂肪酸进行定量；并且很多脂肪酸是没有标准品的，难以确定其母离子和子离子的质荷比；再加上一些长链脂肪酸在质谱中很难碎裂，即使在较高的能量下，产生的信号的也很低，导致这些脂肪酸检测灵敏度较低。
技术实现思路
1、本专利技术是为了克服现有技
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，包括如下步骤：
4、（1）样本提取：用甲醇对血浆或粪便样本进行提取，得到提取后的样本；
5、（2）衍生化反应：向提取后的样本中加入3-硝基苯肼、n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶进行衍生化反应，干燥后得到干粉样品；
6、（3）lc-ms检测：将干粉样品用甲醇水溶液复溶后进行lc-ms检测，得到各待测脂肪酸的含量；其中，质谱检测选择srm模式进行采集；
7、待测脂肪酸的检测母离子质荷比通过以下公式计算：
8、q1=14.0156n-2.0156m+165.9347；
9、其中，n为脂肪酸碳链长度，m为脂肪酸中的碳碳双键个数；
10、检测子离子的质荷比为137.04和152.05。
11、现有技术中用lc-ms法对待测物质进行检测时，一般是通过待测物质的标准品来确定其母离子和子离子的质荷比，这对于没有标准品的脂肪酸来说，就无法对其进行定量，限制了所能检测脂肪酸的数量。为了能够提高可定量脂肪酸的数量，本专利技术先加入3-硝基苯肼、n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐和吡啶对样本中的脂肪酸进行衍生化，根据对衍生化产物的研究发现，其母离子的质荷比可以通过其碳链长度和双键个数根据一定的公式进行计算，并可以同时监测两个子离子137.04和152.05，作为可以定量的诊断峰。对于没有标准品的脂肪酸，可按此进行定量，大大拓展了可定量脂肪酸的数量，并且两个诊断峰处只要在有一处有信号，就可以实现目标脂肪酸的定量，能够实现多种脂肪酸的靶向定量，且衍生化产物的信号较强，具有较高的检测灵敏度。同时，本专利技术仅需用甲醇对样本进行提取即可，提取后的样本无需为干粉状态，在液体状态下可以直接加入衍生化试剂反应，提取和衍生化过程操作简单。
12、作为优选，步骤（1）时样本提取时，样本和甲醇的体积比为1:4~5。
13、作为优选，步骤（1）中的样本提取方法为：将冷冻保存的血浆或粪便样本解冻后，加入甲醇中，涡旋并离心提取后取上清液，得到提取后的样本。
14、作为优选，涡旋时间25~35s；离心时的温度为0~4℃，转速13000~15000rpm，离心时间10~20min。
15、 作为优选，步骤（2）中的3-硝基苯肼、n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐及吡啶以甲醇溶液的方式加入提取后的样本中，3-硝基苯肼溶液的浓度为150~250mmol/l，n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为100~150 mmol/l，吡啶溶液的质量浓度为2~3%；提取后的样本与3-硝基苯肼溶液、n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、吡啶溶液的体积比为4:0.8~1.5:0.8~1.2: 0.8~1.2。
16、作为优选，步骤（2）中的衍生化反应温度为4~35℃，反应时间25~35min。
17、作为优选，步骤（2）中所得干粉样品在-20℃以下保存。
18、作为优选，步骤（3）中，液相色谱测试时的色谱条件为：
19、色谱柱：t3柱或氨基柱；
20、柱温：50~60℃；
21、进样量：2μl；
22、流速：0.3~0.5ml/min。
23、作为优选，步骤（3）中，液相色谱测试时采用梯度洗脱法；采用梯度洗脱的方法，便于各脂肪酸的分离。
24、当色谱柱为t3柱时，流动相a为含有8~12mmol/l乙酸铵的0.15~0.25wt%甲酸水溶液，流动相b为乙腈，洗脱梯度为：
25、0.0~1.0 min：5%体积分数的流动相b；
26、1.0~7.5 min：流动相b的体积分数从5% 到50%；
27、7.5~8.5 min：流动相b的体积分数从50% 到90%；
28、8.5~11.5 min：90%体积分数的流动相b；
29、11.5~12.0 min：流动相b的体积分数从90% 到5%；
30、12.0~17.0 min：5%体积分数的流动相b。
31、当色谱柱为氨基柱时，流动相a为含有18~22mmol/l乙酸铵的4~6wt%乙腈水溶液，流动相b为乙腈，洗脱梯度为：
32、0 min：流动相b的体积分数为85%；
33、0~3 min：流动相b的体积分数从85%到30%；
34、3~12 min：流动相b的体积分数从30%到2%；
35、12~15 min：流动相b的体积分数为2%；
36、15~16 min：流动相b的体积分数从2%到85%；
37、16~20 min：流动相b的体积分数为85%。
38、作为优选，步骤（3）中的质谱条件为：
39、气帘气：20~30psi；本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（1）时样本提取时，样本和甲醇的体积比为1:4~5。
3.根据权利要求1或2所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（1）中的样本提取方法为：将冷冻保存的血浆或粪便样本解冻后，加入甲醇中，涡旋并离心提取后取上清液，得到提取后的样本。
4.根据权利要求3所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，涡旋时间25~35s；离心时的温度为0~4℃，转速13000~15000rpm，离心时间10~20min。
5.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（2）中的3-硝基苯肼、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐及吡啶以甲醇溶液的方式加入提取后的样本中，3-硝基苯肼溶液的浓度为150~250mmol/L，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为100~150
6.根据权利要求1或5所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（2）中的衍生化反应温度为4~35℃，反应时间25~35min。
7.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（2）中所得干粉样品在-20℃以下保存。
8.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（3）中，液相色谱测试时的色谱条件为：
9.根据权利要求8所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（3）中，液相色谱测试时采用梯度洗脱法；
10.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（3）中的质谱条件为：
...【技术特征摘要】
1.一种液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（1）时样本提取时，样本和甲醇的体积比为1:4~5。
3.根据权利要求1或2所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（1）中的样本提取方法为：将冷冻保存的血浆或粪便样本解冻后，加入甲醇中，涡旋并离心提取后取上清液，得到提取后的样本。
4.根据权利要求3所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，涡旋时间25~35s；离心时的温度为0~4℃，转速13000~15000rpm，离心时间10~20min。
5.根据权利要求1所述的液质联用定量检测血浆和粪便中多种脂肪酸的方法，其特征是，步骤（2）中的3-硝基苯肼、n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐及吡啶以甲醇溶液的方式加入提取后的样本中，3-硝基苯肼溶液的浓度为150~250mmol/l，n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙...
【专利技术属性】
技术研发人员：王金龙，王小慧，孙菲菲，张晓婷，沈利叶，
申请(专利权)人：国科大杭州高等研究院，
类型：发明
国别省市：
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