【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物制备及其应用，涉及一种高良姜多糖的制备方法及其在制备抗肝癌药物中的应用，为高良姜多糖临床应用于肝癌的辅助治疗提供科学依据。
技术介绍
1、高良姜是姜科山姜属植物的干燥根茎，主要分布在广东、广西、海南等地。高良姜具有温胃散寒、消食止痛的功效，可以缓解胃病。目前国内外对高良姜的研究主要集中于黄酮、芳香油等化学成分及抑菌、抗肿瘤、降血脂等药理功能上；但针对于高良姜多糖研究仍然较少。
2、肝癌(hcc)是世界范围内排列第五位的最常见的恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。原发性肝癌的病因及确切分子机制尚不完全清楚，目前认为其发病是多因素、多步骤的复杂过程，受环境和饮食双重因素影响。而由于其对化疗的耐受以及手术后极高的复发和转移特性使其成为致死率第三的恶性肿瘤。近年来越来越多的研究证明，hcc的发生可能起源于一群具有干性的细胞亚群，这群细胞被称为肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells，tics)或是肿瘤干细胞(cancer stemcells)。这群细胞表达特定的表面标记，具有自我更新、分化、形成肿瘤以及化疗耐受的特性。虽然，目前索拉菲尼(sorafenib)已经用于靶向治疗hcc，但是其对肿瘤的抑制作用以及肝癌
3、hepg2人肝母细胞株是1979年，aden等和morris等从阿根廷一名15岁高加索男孩的原发性肝胚细胞瘤中分离出并建立。该细胞系呈上皮样，贴壁抱团生长，生长较快，传代说明书1/7页3cn 115671086 a3周期为1-2d，低转移，裸鼠中成瘤率较差，afp阳性，hbsag阴性，细胞系分化程度较高，细胞里代谢酶的生物转化特性较完整，不需加入外源性活化系统。在药物作用相关研究中代谢酶保持稳定，不会因传代次数增多而有所改变，所含有的生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞同源，因此，常被用于体外肝细胞代谢或遗传毒性试验方面的理想细胞系。其中，hepg2.2.15是目前应用较为广泛的细胞株，它是hepg2的衍生物，即用2个头尾相连的hbvdna全基因的重组质粒转染受体细胞hepg2而得，可在体外无性繁殖，能够长期稳定的分泌hbsag、hbeag和完整的dane颗粒，产生大量的复制中间体，是体外筛选抗hbv药物的良好模型，并用于抗hbv新药开发的体外研究工具。
4、目前有研究报道高良姜提取物改善胰岛素抵抗作用显著，但对于高良姜多糖应用于抗肝癌药物及其给药浓度未见详细报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种高良姜多糖的制备方法，通过特定的制备工艺获得高良姜酸性多糖，所述高良姜酸性多糖具有显著改善胰岛素抵抗作用。
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供一种高良姜多糖的制备方法，包括以下步骤：
3、步骤s1、高良姜根茎洗净后粉碎，过筛，高良姜粉末用热水回流提取数次，合并提取液并减压浓缩，并经沉淀、sevag法脱蛋白，透析、冷冻、干燥得到粗多糖ahp；
4、步骤s2、粗多糖溶解后分离，依次用超纯水、0.1m nacl、0.2m nacl、0.3m nacl溶液进行洗脱,收集洗脱液；
5、步骤s3、用苯酚-硫酸法测定每管洗脱液的糖含量；
6、步骤s4、重蒸苯酚用蒸馏水配制成测试液，以葡萄糖为标准品，用重蒸馏水准确配制葡萄糖标准母液；标准曲线按葡萄糖标准母液为：0.0，30.0，60.0，90.0，120.0，150.0，180.0μg/ml分别配制，定容于50ml容量瓶中；
7、步骤s5、测定时分别取各标准母液，加入苯酚测试液，混悬振荡器混合均匀后，快速加入浓硫酸，混悬振荡，室温下放置，测定吸光度值；
8、步骤s6、以标准品吸光值-蒸馏水吸光值为纵坐标，以葡萄糖标准品浓度为横坐标，绘制计算硫酸-苯酚标准曲线，计算回归方程；
9、步骤s7、称取多糖样品，定容于容量瓶后测定吸光度值，代入标准曲线方程计算各样品浓度；
10、步骤s8、绘制多糖含量-管数曲线，根据曲线收集多糖；经过浓缩、透析和冷冻干燥后得到初步纯化的高良姜多糖；
11、步骤s9、用sephadex g-100色谱柱，以超纯水为洗脱液，进一步纯化多糖，再次测定糖含量及绘制多糖含量-管数曲线；
12、步骤s10、经浓缩和冷冻干燥后得到纯化多糖。
13、进一步地，步骤s1中，高良姜粉碎后过60目筛。
14、进一步地，步骤s1中，热水回流温度为100℃，提取次数为3次，每次1h。
15、进一步地，步骤s1中，合并提取液并减压浓缩至原体积的10％-20％；加入95％乙醇至乙醇浓度为60％，在4℃下沉淀12h。
16、进一步地，步骤s2中，洗脱液使用自动部分收集器收集，每管30分钟，流速0.5ml/min。
17、本专利技术的另一目的在于提供一种高良姜多糖在制备抗肝癌药物中的应用，为高良姜多糖临床应用于肝癌的辅助治疗提供科学依据。
18、本专利技术一种高良姜多糖在制备抗肝癌药物中的应用，将本专利技术制备获得的高良姜多糖应用于制备治疗和/或预防抗肝癌疾病药物。
19、进一步地，所述高良姜多糖的给药浓度为0.1-0.5mg/ml。
20、进一步地，所述高良姜多糖的给药浓度为0.1mg/ml。
21、进一步地，所述高良姜多糖的给药浓度为0.3mg/ml。
22、进一步地，所述高良姜多糖的给药浓度为0.5mg/ml。
23、本专利技术高良姜多糖的制备方法及其在制备抗肝癌药物中的应用具有以下的有益效果：
24、1、本专利技术首次发现通过本专利技术特定的制备方法获得的高良姜酸性多糖具有良好的抑制hepg2细胞株增殖的作用以及从发病机理方面，具有良好的预防和治疗肝癌的药用价值。
25、2、本专利技术获得的高良姜多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、半乳糖醛酸组成，摩尔百分比分别为8.9％、16.9％、21.4％、11.8％、35.4％，含有少量的岩藻糖(0.5％)及葡萄糖醛酸(2.0％)，不含有甘露糖。化学组成及单糖组成分析的结果都显示出ahp-3a含有高含量的糖醛酸，表明本专利技术高良姜多糖为酸性多糖。
26、3、通过本专利技术实验发现，选择0.1、0.3、0.5mg/ml的高良姜多糖给药浓度抑制了肝癌细胞hepg2的细胞迁移、侵袭效果最佳。
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1.一种高良姜多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高良姜多糖的制备方法，其特征在于：步骤S1中，高良姜粉碎后过60目筛。
3.根据权利要求1所述的高良姜多糖的制备方法，其特征在于：步骤S1中，热水回流温度为100℃，提取次数为3次，每次1h。
4.根据权利要求1所述的高良姜多糖的制备方法，其特征在于：步骤S1中，合并提取液并减压浓缩至原体积的10％-20％；加入95％乙醇至乙醇浓度为60％，在4℃下沉淀12h。
5.根据权利要求1所述的高良姜多糖的制备方法，其特征在于：步骤S2中，洗脱液使用自动部分收集器收集，每管30分钟，流速0.5mL/min。
6.一种高良姜多糖在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于：将权利要求1-6任何一项获得的高良姜多糖应用于制备治疗和/或预防抗肝癌疾病药物。
7.根据权利要求7所述的高良姜多糖在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于：所述高良姜多糖的给药浓度为0.1-0.5mg/ml。
8.根据权利要求7所述的高良姜多糖在制备抗肝癌药物中的应用
9.根据权利要求7所述的高良姜多糖在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于：所述高良姜多糖的给药浓度为0.3mg/ml。
10.根据权利要求7所述的高良姜多糖在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于：所述高良姜多糖的给药浓度为0.5mg/ml。
...【技术特征摘要】
1.一种高良姜多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高良姜多糖的制备方法，其特征在于：步骤s1中，高良姜粉碎后过60目筛。
3.根据权利要求1所述的高良姜多糖的制备方法，其特征在于：步骤s1中，热水回流温度为100℃，提取次数为3次，每次1h。
4.根据权利要求1所述的高良姜多糖的制备方法，其特征在于：步骤s1中，合并提取液并减压浓缩至原体积的10％-20％；加入95％乙醇至乙醇浓度为60％，在4℃下沉淀12h。
5.根据权利要求1所述的高良姜多糖的制备方法，其特征在于：步骤s2中，洗脱液使用自动部分收集器收集，每管30分钟，流速0.5ml/min。
6.一种高...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘宜鹏，徐剑，文欢，邝杨君，祝哲，周明艳，谢振蕊，
申请(专利权)人：海南医学院第二附属医院，
类型：发明
国别省市：
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