【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，属于医学检验检测。
技术介绍
1、中药等天然药物存在成分多、结构复杂等问题，而在人体药代动力学研究中，存在体内药效与药物浓度关系不清等问题。制定合理的人体内药代动力学研究方法是解决上述问题的必要条件。考虑到生物样品的低丰度和复杂的基质效应，利用稳定同位素标记对体内药物进行绝对定量是一种有效的方法。然而，天然药物含有多种成分，使得目标化合物的商业内标和难以承受的价格，其中稳定同位素的数量更少。
2、雷公藤多苷片是从传统中药雷公藤中提取的。在临床中具有显著的抗炎和免疫抑制作用，可用于类风湿关节炎、肾病、亚急性甲状腺炎、自身免疫性疾病等疾病。雷公藤多苷片广泛应用于糖尿病肾病的临床治疗。是目前治疗糖尿病肾病不可替代的一线药物。但其毒性大，临床应用时需长期服用，才能根据指标变化确定雷公藤多苷片的有效剂量，对患者生殖系统危害较大。此外，目前研究的雷公藤甲素a、雷公藤甲素b等化合物毒性较大，无法解释其疗效。
3、去甲泽拉木醛是从雷公藤中提取的一种三萜单体化合物，可能是雷公藤多苷片的有效成分。最早由复旦大学中山医院药物科学研究实验室于上世纪90年代提取。与从雷公藤中提取的其他单体相比，去甲泽拉木醛具有较强的免疫抑制作用，毒性较小，中位致死剂量为283.37～288.37mg kg-1。同时，它在雷公藤中含量丰富，便于提取。但是，以往的研究大多是在体外通过内部指标的变化来确定疗效，而不是直接检测体内去甲泽拉木醛的含量。事实上，在体内对去甲泽拉木醛进行定量分析的研究很少，而
4、目前，由于血清显著且个体差异的基质效应所导致的去甲泽拉木醛定量的可靠性不足，缺乏可靠的去甲泽拉木醛定量方法。本研究试图通过优化分离方法和采用固相微萃取技术(spe)条件，以减少基质的影响，同时提高方法回收率。同时，作为血清中罕见的低丰度化合物，其同位素内标的合成相对复杂，导致同位素内标市场较小，价格昂贵。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是：提供一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法。本实验试图用18o交换法制备一种稳定同位素内标，定量血清中去甲泽拉木醛。该方法对复杂基质样品中多种低丰度中药成分的定量具有推广意义。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，包括以下步骤：
4、(1)18o标记的合成；
5、(2)血清样本处理；
6、(3)uplc-mrm分析；
7、(4)数据处理。
8、所述18o标记的合成是指：用h218o将30μl 1mg ml-1去甲泽拉木醛溶液稀释至100μgml-1(含1％甲酸)，95℃pcr孵育15h；取出-20℃保存备用。
9、所述血清样本处理是指：将100μl血清与400μl 50％甲醇和1％甲酸混合；将混合物涡旋3min,13300rpm离心10min，收集上清液，稀释至含50％甲醇；稀释后的样本用spe进行处理；然后将洗脱液在45℃真空浓缩器中干燥，用30μl的20ng/ml18o标记的同位素内标进行复溶；将重组溶液涡旋10分钟，然后在13300rpm转速下离心10分钟，取上清液进行样品检测。
10、所述稀释后的样品用spe进行处理是指：稀释后的样品上样于oasis prime hlbspe小柱，以3ml 50％的甲醇水溶液洗涤小柱后，以1ml乙腈：甲醇＝9：1的溶液洗脱，收集洗脱液。
11、所述uplc-mrm分析是指：采用waters uplc-q-tof-ms系统(h-class uplc-synaptg2-si hdms,ma)，采用waters acquity beh c18(2.1×50mm,1.7μm)进行分离；流动相a为乙腈溶液，流动相b为0.1％甲酸水溶液；液相洗脱，流速0.3ml/min，柱温设置为30℃，进样量为3μl；质谱条件：采用正态mrm进行数据采集，按多反应监测离子对条件进行。
12、所述述液相洗脱的条件为：
13、表1：梯度洗脱
14、
15、
16、所述多反应监测离子对条件为：
17、表2：多反应监测离子对条件
18、
19、所述数据处理是指：采用targetlynx(waters,ma,usa)进行峰整合和定量。
20、所述血清样本为以雷公藤多苷片治疗糖尿病肾的患者的血清样本。
21、本专利技术的另一个专利技术目的，是提供了去甲泽拉木醛用于制备检测雷公藤多苷片治疗糖尿病肾病药效的临床生物标志物的用途。
22、本专利技术首次建立了以去甲泽拉木醛为例的血清中天然药物快速、便捷的准确定量策略。通过实验，逐步确定了一种较好的spe法提取血清中去甲泽拉木醛。在我们的研究中，使用同位素标记的内标对所有分析物规避了这些分析陷阱和挑战。采用16o/18o交换反应制备了去甲泽拉木醛的同位素内标，该内标满足大量样品的实验稳定性。此外，18o标记与离线spe相结合可以满足去甲泽拉木醛tdm的需要，这在去甲泽拉木醛或雷公藤多苷片的临床应用领域可能具有重要意义。该方法也可应用于其他许多低丰度中药成分的定量分析。
23、本专利技术的优点如下：本专利技术提出了一种新的结合离线spe的18o标记定量方法。我们比较了各种分离方法的回收率和基质效应，以选择最佳的分离方法。此外，我们还优化了spe的加载和洗涤条件。通过16o/18o交换反应制备了同位素内标物。该方法的精度和精度都满足了方法验证的要求。该方法的回收率接近60％。高浓度样品的相对标准差(rsd)为2％，检测限(lod)为1ng/ml。该方法可用于分析临床去甲泽拉木醛的血清浓度。我们收集了10例糖尿病肾病患者的60例样本。采用该方法获得的患者血清中去甲泽拉木醛的定量结果显示，治疗性药物监测(tdm)与尿蛋白降低之间存在相关性。这项工作可能对体内药物代谢的研究和低丰度30和难以量化的天然生物活性化合物的临床应用具有广泛的意义。
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1.一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，所述18O标记的合成是指：用H218O将30μl 1mg ml-1去甲泽拉木醛溶液稀释至100μgml-1(含1％甲酸)，95℃PCR孵育15h；取出-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，所述血清样本处理是指：将100μl血清与400μl 50％甲醇和1％甲酸混合；将混合物涡旋3min,13300rpm离心10min，收集上清液，稀释至含50％甲醇；稀释后的样品用SPE进行处理；然后将洗脱液在45℃真空浓缩器中干燥，用30μl的20ng/mL18O标记的同位素内标进行复溶；将重组溶液涡旋10分钟，然后在13300rpm转速下离心10分钟，取上清液进行样品检测。
4.根据权利要求3所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，所述稀释后的样品用SPE进行处理是指：稀释后的样品上样于Oasis PRiME HLB SPE小柱，以3ml50％的
5.根据权利要求1所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，所述UPLC-MRM分析是指：采用waters UPLC-Q-TOF-MS系统(H-Class UPLC-Synapt G2-Si HDMS,MA)，采用Waters ACQUITY BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)进行分离；流动相A为乙腈溶液，流动相B为0.1％甲酸水溶液；液相洗脱，流速0.3ml/min，柱温设置为30℃，进样量为3μl；质谱条件：采用正态MRM进行数据采集，按多反应监测离子对条件进行。
6.根据权利要求5所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，所述液相洗脱的条件为：
7.根据权利要求5所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于：所述多反应监测离子对条件为：
8.根据权利要求1所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，所述数据处理是指：采用Targetlynx(waters,MA,USA)进行峰整合和定量。
9.根据权利要求1至9任一所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于：所述血清样本为以雷公藤多苷片治疗糖尿病肾的患者的血清样本。
10.去甲泽拉木醛用于制备检测雷公藤多苷片治疗糖尿病肾病药效的临床生物标志物的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，所述18o标记的合成是指：用h218o将30μl 1mg ml-1去甲泽拉木醛溶液稀释至100μgml-1(含1％甲酸)，95℃pcr孵育15h；取出-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，所述血清样本处理是指：将100μl血清与400μl 50％甲醇和1％甲酸混合；将混合物涡旋3min,13300rpm离心10min，收集上清液，稀释至含50％甲醇；稀释后的样品用spe进行处理；然后将洗脱液在45℃真空浓缩器中干燥，用30μl的20ng/ml18o标记的同位素内标进行复溶；将重组溶液涡旋10分钟，然后在13300rpm转速下离心10分钟，取上清液进行样品检测。
4.根据权利要求3所述的一种血清中去甲泽拉木醛的定量检测方法，其特征在于，所述稀释后的样品用spe进行处理是指：稀释后的样品上样于oasis prime hlb spe小柱，以3ml50％的甲醇水溶液洗涤小柱后，以1ml乙腈：甲醇＝9：1的溶液洗脱，收集洗脱液。
5.根据权利要求1所述的一种血清中去甲...
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