【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肝病动物模型，具体而言，涉及一种猕猴肝纤维化或肝硬化疾病模型的构建方法。
技术介绍
1、肝脏作为机体以代谢功能为主的器官，是物质和能量代谢的重要枢纽。各种有害因素如病毒、药物、毒物、酒精、外伤、遗传因素等引起肝脏功能和形态受损，出现氧化应激和炎症反应，造成急性或慢性肝病。如果肝损伤得不到有效控制和缓解，持续的肝细胞损伤导致发展为肝纤维化。肝纤维化是肝硬化的前兆，是所有慢性肝病向肝硬化发展的关键病理过程。多种肝病经肝纤维化最终发展为肝硬化，并伴有肝细胞癌和肝功能衰竭等其他并发症。
2、现阶段许多肝脏疾病还缺乏针对性和有效的药物，造成肝疾病的新药研发面临许多重大挑战。传统的新药研发主要通过细胞和动物模型进行评价，而肝脏疾病的复杂性和多阶段性使得难以充分了解肝脏疾病的各个阶段，因此使用有限的动物模型进行药物评价具有片面性。构建能够模拟人体肝纤维化、肝硬化发生发展过程的理想动物模型成为肝病早期诊断、致病机制探索、相关药物和治疗策略评价、改善肝病病情和预后评估的关键。
3、由于肝病发病机制复杂和肝损伤因素的多样性，以及防治的途径、方法和药物类型亦较复杂，因此应参考肝病不同的发病机制及其临床症状，选择多种不同的动物模型，如疾病模型、病证结合模型等，评价肝病的病因、病理生理以及相关治疗药物的研发。其中，四氯化碳诱导模型是经典的肝病造模方法，操作简便、造模周期短、成功率高。
4、灵长类动物是人类的近亲，其组织结构、免疫、生理和代谢、生殖、大脑活动和行为方式等很多方面与人类高度相似，利用灵长类动物
5、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种猕猴肝纤维化或肝硬化疾病模型的构建方法以解决上述技术问题。
2、本专利技术是这样实现的：
3、第一方面，本专利技术提供了一种猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其包括如下步骤：
4、给予成年猕猴灌胃诱导试剂，诱导试剂包括体积比为(3-5)：(5-7)的四氯化碳和橄榄油，灌胃条件如下：
5、第1-4周或第1-5周，每周灌胃1次诱导试剂，剂量为0.8-1.2ml/kg；
6、第5-8周或第6-9周，每周灌胃2次诱导试剂，剂量为0.8-1.2ml/kg；
7、第9-10周起，每周灌胃2次诱导试剂，剂量为1.8-2.2ml/kg，直至猕猴具有肝纤维化特征。
8、本专利技术提供的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法具有模型构建成功率高、安全性好的优势。通过直接灌胃的方式，相比于腹腔注射具有更高的建模成功率和安全性，腹腔注射容易引起肠道黏连和病变，严重导致猕猴死亡。采用循序递增灌胃法灌胃猕猴，持续诱导猕猴肝损伤，逐步实现猕猴肝脏纤维化及肝硬化病变。通过逐步提高灌胃频率和给药剂量，使动物在初期能够缓慢适应，减少急毒性损伤，更符合慢性肝病临床致病特点。
9、与现有技术相比，本专利技术无需高脂饮食和联合其他肝损伤试剂，采用四氯化碳单一致病因素进行诱导，有利于肝病致病机制研究和药物研发及评价。设置四氯化碳单因素诱导，具有操作简便、成本低廉的优势，能很好地模拟人类肝纤维化s0-s4期的病理变化，且与乙肝病毒感染后的病理特征相似。
10、此外，本专利技术选取与人类亲缘关系更为接近的非人灵长类动物猕猴，其免疫系统、代谢系统等方面相较于其他模型动物与人更为接近，利用猕猴创建的肝病模型能更好的模拟人肝病临床表现，能够准确反映人类慢性肝病的发生、发展及治疗和预后，更有利于肝病致病机制研究和生物大分子药物的筛选和评价。
11、在一种可选的实施方式中，诱导试剂包括体积比为3:7、3:5、3:6、4:5、4:6、4:7、5:5、5:6或5:7的四氯化碳和橄榄油。四氯化碳对于胃粘膜具有一定的刺激性，且无色无味，通过橄榄油与四氯化碳混合，能够起到保护胃粘膜的作用，减少四氯化碳对于猕猴胃粘膜的刺激。经过长期大量的筛选，选择具有上述体积比的四氯化碳和橄榄油，能够起到良好的诱导效果。若四氯化碳添加量过少，橄榄油过多，会导致诱导的猕猴表现为脂肪肝的疾病，无法获得肝纤维化和肝硬化的疾病表现。若四氯化碳添加量过多，又会由于毒性太高导致猕猴存活率低，建模成功率下降。
12、在本专利技术应用较佳的实施方式中，灌胃至18-26周，使得猕猴具有肝纤维化特征。由于不同的猕猴存在个体的诱导试剂耐受能力、年龄等差异，因此，只要猕猴具有肝纤维化特征，均属于本专利技术的保护范围，并不限于上述的灌胃持续时长。例如灌胃持续时长提前1-2周或滞后1-2周也均在本专利技术的可选范围之内。
13、在本专利技术应用较佳的实施方式中，猕猴具有肝纤维化特征是指如下至少一种特征：
14、猕猴的血清中的总胆红素水平显著升高(大于5μmol/l)、血清中肝功能相关指标与灌胃前相比升高、白蛋白下降、血清中的iv型胶原水平显著升高、血清中的甘胆酸水平显著上升、血清中的iii型前胶原n端肽水平显著升高、层黏蛋白水平显著升高、右肝斜径增大、肝包膜回声增强、肝包膜增厚、肝实质区的回声增强、肝实质区的颗粒增粗、肝实质区不均匀、肝实质区存在散在点状强回声、肝实质区的门脉增宽、肝实质区的瞬时弹力值>9kpa、弥漫性脂肪细胞变性、肝脏的门管区小叶及窦周出现纤维化、肝脏的门管区小叶及窦周呈宽松弥散状、肝脏的纤维化区域内伴有炎性细胞浸润和细胞坏死和肝脏中i型和iii型胶原物质沉积。
15、通过血液学检测、病理学检测、影像学检测中的至少一种方法实现肝纤维化的诊断或评价。本领域的技术人员可以根据需要结合血液学检测、病理学检测和影像学检测来综合评估猕猴是否具有肝纤维化，以实现更为准确地诊断肝细胞损伤。
16、本领域的技术人员容易实现，仅通过血液学检测实现肝细胞损伤的诊断，或通过血液学检测和影像学检测肝细胞损伤的无创体外诊断。
17、针对猕猴的血液学检测或影像学检测，本领域的技术人员可以根据需要调整猕猴的血清生化标志物、血清肝纤维化标志物的检测频率，包括不限于每4周、每3周、每2周或每周检测猕猴的血清生化标志物、血清肝纤维化标志物从而实现猕猴的肝细胞损伤的持续监控。本领域的技术人员也可以根据需要调整猕猴的影像学检查频率，例如每4周或每2周对猕猴的肝脏进行影像学检查和评估。也可根据检查的结果调整检查的周期。
18、在一种可选的实施方式中，通过静脉采血从而对猕猴的血清生化标志物、血清肝纤维化标志物进行相应的检测。采用彩超仪对猕猴的肝脏进行检查。
19、为了进行病理学检测，本领域的技术人员也可在灌胃之前，灌胃期间或灌胃后进行超声引导穿刺或活体肝取材手术，切取部分肝样本进行检测。
20、在本专利技术应用较佳的实施方式中，血清中肝功能相关指标与灌胃前相比升高包括如下至少一种肝功能相关指标与灌胃前相比升高：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶和γ-谷氨酰转肽酶。在一种实施方式中，血清中肝功能本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，灌胃至18-26周，使得所述猕猴具有肝纤维化特征。
3.根据权利要求2所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，所述猕猴具有肝纤维化特征是指如下至少一种特征：
4.根据权利要求3所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，所述血清中肝功能相关指标与灌胃前相比升高包括如下至少一种肝功能相关指标与灌胃前相比升高：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶和γ-谷氨酰转肽酶。
5.根据权利要求1所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，所述成年猕猴为成年雄性猕猴；
6.一种猕猴肝硬化疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的猕猴肝硬化疾病模型的构建方法，其特征在于，所述猕猴具有肝硬化特征是指如下至少一种特征：
8.根据权利要求6所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，所述成年猕猴为成年雄性猕猴；p>
9.如权利要求1-5任一项所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法构建的猕猴肝纤维化疾病模型在筛选制备治疗肝纤维化疾病药物、或在筛选制备治疗肝纤维化疾病的干细胞中的应用。
10.如权利要求6-8任一项所述的猕猴肝硬化疾病模型的构建方法构建的猕猴肝硬化疾病模型在筛选制备治疗肝硬化疾病药物、或在筛选制备治疗肝硬化疾病的干细胞中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，灌胃至18-26周，使得所述猕猴具有肝纤维化特征。
3.根据权利要求2所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，所述猕猴具有肝纤维化特征是指如下至少一种特征：
4.根据权利要求3所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，所述血清中肝功能相关指标与灌胃前相比升高包括如下至少一种肝功能相关指标与灌胃前相比升高：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶和γ-谷氨酰转肽酶。
5.根据权利要求1所述的猕猴肝纤维化疾病模型的构建方法，其特征在于，所述成年猕猴为成年雄性猕...
【专利技术属性】
技术研发人员：张新尚，辜玉刚，杨帆，王果，
申请(专利权)人：四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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