【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种模拟ad发病过程的小鼠模型及其构建方法。
技术介绍
1、阿尔茨海默症（以下简称“ad”），是老年人中最常见的神经退行性疾病，其特征是记忆功能障碍，在临床上主要表现为认知功能障碍、自理能力逐渐下降和精神障碍，主要的病理特征是由细胞内聚集的β淀粉样蛋白（aβ）形成的老年斑块和细胞外沉积的磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结（nfts）组成。已有研究发现，ad病理特征中的β淀粉样蛋白（aβ）聚集和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结（nfts）的形成，可能与calnexin（cnx）的功能失调有关。cnx是一种膜结合分子伴侣，与其他可溶性内质网腔内同源物钙网蛋白，协助参与新生糖蛋白的折叠、加工和质量控制。kraus等发现，cnx缺乏的小鼠出生时可存活，但新生儿死亡率高，且患有神经系统疾病，包括共济失调和周围神经病变异常，表现为步态不稳、后肢伸展、震颤和滚动行走。
2、根据世界范围内收集的统计数据，随着年龄的增长，患病风险逐渐增加，65岁以后，ad的发病率每5年翻一番。据who的数据表明，预计到2030年，全球ad患者将达到5000万。其中中国ad患者将约1500万，而随着全球老龄化加剧，数字还在急剧增加。但截至目前，针对ad尚无有效的治愈方法，由于对ad的病因和发病机制不完全了解，至今还没有有效的治疗方法，99%的ad新药开发在ii/iii期以失败告终。
3、为了加强临床医学转化研究以及临床前药物筛选，迫切需要发展和开发相关的动物模型。ad动物模型是以实验动物模拟ad患者
4、（1）app转基因小鼠模型：将人源性app基因与小鼠基因组整合、表达和遗传。与正常动物相比，app转基因动物脑中aβ表达过量，引起认知功能障碍等系列ad临床病理特征。与ad患者不同，app转基因小鼠尚未拥有nft神经病理改变，多数只有tau蛋白过度磷酸化。
5、（2）双转基因和三转基因小鼠模型：将app转基因小鼠和tau转基因小鼠进行交配，得到app/tau过表达的双转基因小鼠；进一步跟psen1(presenilins 1)转基因小鼠交配，则可得到app/tau/psen1三转基因小鼠。虽然app/tau和app/tau/psen1转基因小鼠模型部分较好地重现：aβ沉积和tau过度磷酸化且具nft样结构生成，但二基因/三基因ad模型小鼠存在出生率低，出生培养困难，寿命短且ad行为特征差异较大，也侧面说明该模型与人体ad发病的机制存在较大的差异。
6、（3）穹隆海马伞损伤模型：采用手术方法损伤隔区胆碱能神经纤维至海马与皮质的投射，从而破坏胆碱能诱发动物学习、记忆障碍。术后动物出现学习记忆功能障碍，但未出现aβ和nft病变，损伤范围大，需要实施者非常熟练方可构建成功，动物模型较难批量化生产和销售。
7、目前，国内的市售的ad小鼠模型主要以app小鼠和app/tau/小鼠和app/tau/psen1小鼠为主，中国专利《cn201510990290.3 一种产生ho-1/app/psen1三转基因阿尔茨海默病小鼠模型的方法》公开了一种ho-1/app/psen1三转基因小鼠，该专利核心技术是ho-1替代了app/tau/psen1中的tau，所构建的小鼠并未与app/tau/psen1进行对比，且在寿命和病理特征上并未有明显的差异。
8、综上所述，ad的发病原因和病程机制仍未彻底揭开，针对aβ和nft作为靶点的新药开发几乎毫无进展，因而能够“模拟ad自然发病过程”的小鼠模型及其构建方法，对于ad机制的研究和作为药物临床前的动物试验，具有至关重要的作用。
技术实现思路
1、针对现有的技术难题，本专利技术提供一种“模拟ad自然发病过程的小鼠模型”的小鼠模型构建方法，在健康成年小鼠的海马区实现cnx基因的敲低，实现“模拟ad自然发病”这一病理学过程。
2、具体的，本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术的第一方面提供一种“模拟ad自然发病过程的小鼠模型”的小鼠模型构建方法，采用微创的方法将携带有cnx敲除基因的重组载体(syn-cnx-kd)导入小鼠脑部海马区完成神经元cnx基因的敲低，从而实现 “模拟ad自然发病过程”。
4、本专利技术的第二方面提供一种新型的“模拟ad自然发病过程”的小鼠模型，该小鼠模型的脑部海马区cnx基因的表达量比野生型小鼠低40%以上，伴随aβ样蛋白增加和tau蛋白磷酸化所引起的nft聚集，行为上表现出与ad小鼠趋于一致的病理学行为特征。
5、本专利技术的第三方面提供了全新的ad小鼠模型，其基因靶点为海马区cnx基因被敲低，基因表达量下降40%以上。
6、本专利技术的第四方面提供了靶基因cnx基因敲除的载体系统，包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、cre-lox和crispr-cas系统。
7、在本专利技术中，所述的对获得的小鼠模型的鉴定方法，包括ad疾病关联的分子检测、病理、免疫组化分析和行为学特征观察。
8、在本专利技术中，所述cnx-d模型小鼠通过以下方法制备得到：
9、1. 分别克隆cnx基因上游和下游重组同源片段，酶切连接；
10、2. 将1所克隆的片段连入载体构成psyn-cnx-ko敲除载体；
11、3. 制备微创注射用的dna溶液；
12、4. 应用微创注射法将构建的重组载体注入到小鼠脑部海马区，筛选阳性克隆即得。
13、本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
14、1. 本专利技术提供的“模拟ad自然发病过程”的小鼠模型构建方法，相对于“人工衰老方法”具有时间短、重现好、阳性成功率高（cnx基因敲低1月后表达量下降40%以上，阳性率80%以上）。
15、2. 本专利技术所构建的“模拟ad自然发病过程”的小鼠模型，与双基因和三基因转基因小鼠相比，体征和寿命与野生型无明显差异，病态进展过程表现更为自然（一般1个月后开始出现与app小鼠类似的行为学特征）。
16、3. 与手术法物理法相比，处理方法更温和，靶区特异性强，脱靶概率低，对非靶区的其他脑区几乎不影响，有效排除其他因素干扰，非常适合病理基础研究和药物开发的临床前研究。
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1.一种模拟AD自然发病过程的小鼠模型构建方法，其特征在于，将携带有CNX片段的基因敲除重组载体导入成年健康小鼠脑部海马区，完成海马区CNX基因的敲低，进而破坏神经元，实现“模拟AD自然发病过程”的小鼠模型构建。
2.权利要求1所构建的小鼠模型，敲低的靶点为海马区的CNX基因，其特征在于，敲低后脑部海马区CNX基因的表达量比野生型小鼠降低40%及以上，伴随Aβ样蛋白增加和Tau蛋白磷酸化所引起的NFT聚集，行为学上表现出与AD小鼠趋于一致的病理学行为特征。
3.权利要求1和2所述的CNX基因敲除载体系统，包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、Cre-Lox和CRISPR-Cas系统。
4.权利要求1和2所述的模型小鼠通过以下方法制备得到：
【技术特征摘要】
1.一种模拟ad自然发病过程的小鼠模型构建方法，其特征在于，将携带有cnx片段的基因敲除重组载体导入成年健康小鼠脑部海马区，完成海马区cnx基因的敲低，进而破坏神经元，实现“模拟ad自然发病过程”的小鼠模型构建。
2.权利要求1所构建的小鼠模型，敲低的靶点为海马区的cnx基因，其特征在于，敲低后脑部海马区cnx基因的表达量比...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴文贤，王小静，崔理立，谢玉莹，王永香，
申请(专利权)人：广东医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：
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