【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于益生菌药物，尤其涉及一种用于缓解环境毒素诱导的精子发生障碍的复合益生菌的制备方法和应用。
技术介绍
1、不孕不育问题已经成为世界性公共问题，引起不育的原因中源于男性的因素占到近50％，其中男性精子数量和质量的下降是导致男性不育的重要因素之一。从1980年至2021年世界卫生组织(who)《人类精液检查与处理实验室手册》1-6版中精液参数正常参考值不断下降反映出全球男性精液质量在逐渐降低。精子发生是指精子在睾丸中从形成到成熟的全部过程，包括有丝分裂和减数分裂以及从生殖细胞到成熟精子的分化过程。适龄男性生精障碍的诱导因素很多，环境污染物可能是影响男性精子发生的重要因素之一，包括人类产生的和自然产生的化学物质。黄曲霉毒素b1(afb1)是一种典型的自然产生的环境污染物，afb1主要由曲霉、青霉和镰刀菌等产毒真菌产生的次生代谢物。afb1在人类食物、地表水源和居住环境、不育男性的精子、人类母乳和脐带血均被报道检测出afb1，暗示afb1污染的广泛性及在体内的蓄积性。afb1同样也被认为是内分泌干扰物质(edcs)，可通过干扰下丘脑-垂体-性腺轴(hpg)的内分泌，抑制精子发生。研究表明afb1可以通过大鼠的血脑屏障影响下丘脑分泌促性腺激素释放激素(gnrh)，抑制睾酮的合成。afb1下调睾酮合成相关基因(star、cyp11a1、3β-hsd等)的表达，诱导间质细胞凋亡，抑制睾酮的合成。afb1诱导睾丸支持细胞异常自噬，破坏血睾屏障影响精子发生。精子离体实验证明afb1可诱导雄性动物精子过早的顶体反应、通过增加线粒体膜电位
2、环境污染物诱导的精子发生障碍中，支持细胞(scs)的异常自噬可能是污染物生殖毒性的关键靶点。支持细胞与发育中的生殖细胞一起位于精索小管内，为生殖细胞提供物理依附点和营养支持，并通过紧密连接形成血睾屏障为精子的生成和成熟提供了适宜的微环境。自噬是一种细胞内降解的通路，是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程，其中以溶酶体介导的非选择性自噬最为常见。scs的主要自噬活动包括降解精小管中不必要的成分，调节正常的细胞骨架组织，调节性激素的合成、es碎片的降解、btb周期性的变化、以及能量代谢等。已经报道afb1可调控睾丸组织、间质细胞和支持细胞的自噬，但afb1是抑制还是激活自噬报道不一致，这可能取决于细胞的状态，但还缺乏评价标准。
3、提高睾丸组织的抗氧化水平促进精子发生可能是缓解环境污染物诱导生精障碍的有效策略，其中nrf2抗氧化通路可能是治疗睾丸功能障碍的新靶点。益生菌具有体外降解afb1和激活nrf2抗氧化通过提高细胞抗氧化水平的能力，有可能成为缓解afb1生殖毒性的新策略。已有研究报道益生菌在雄性生殖系统的应用，如：益生菌可通过激活激素受体的表达，提高鳗鱼和大鼠体内总睾酮(t)水平；益生菌可提高小鼠睾丸抗氧化酶基因(谷胱甘肽过氧化物酶等)的表达，降低氧化应激，提高精子活力；益生菌在体外可降低二价铁离子诱导的精子脂质过氧化，提高精子的体外生存能力。我们前期的研究已经证明干酪乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌具有afb1降解能力，干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌酿酒酵母都属于典型的益生菌已经在人类疾病防治或食品中广泛使用，但3种益生菌在男性生殖系统中的应用潜力尤其是对afb1诱导的生殖障碍保护效果还鲜有报道。。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种用于缓解环境毒素诱导的精子发生障碍的复合益生菌的制备方法和应用，小鼠睾丸支持细胞tm4细胞系已经广泛用于外源物物对雄性生殖系统的评估，本文将通过选用tm4细胞系评估三种益生菌对afb1诱导生殖毒性可能的保护机制。本实验的开展将为为后续进一步探索afb1损伤男性生殖系统的机制和挖掘益生菌在雄性生殖系统中的应用潜力提供新证据。
2、为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
3、一种复合益生菌，由干酪乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌按质量比1：1：1混合而成，其中干酪乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的活菌数均为1.0×105cfu/g，该复合益生菌对afb1降解率为40.55％。
4、进一步的，利用上述复合益生菌制备的菌体上清液，在上清液和tm4细胞共同孵化时，当复合上清液中菌体浓度为1.0×104cfu/ml时，细胞活力为116.86％。
5、进一步的，上述复合益生菌通过介导nrf2抗氧化通路降低黄曲霉毒素b1诱导的tm4细胞自噬通量，用于制备治疗由afb1诱导的生殖障碍的药物中，特别是生精障碍药物中。
6、进一步的，上述菌体上清液通过激活nrf2抗氧化通路降低lc3蛋白的表达，自噬体数量和ros水平，缓解afb1诱导的细胞毒性，用于制备治疗由afb1诱导的生精障碍的药物中。
7、进一步的,上述复合益生菌进行动物实验，当复合益生菌中三种活菌数均为1.0×107cfu/ml时，结果表明afb1以150μg/kg体重连续灌胃28d，显著降低睾丸重量、降低精子数量和活力。添加复合益生菌后睾丸重量、精子数量和活力恢复到正常水平。
8、本专利技术具有的优点是：本专利技术益生菌具有降解afb1和抗氧化特性，具有治疗生精障碍的潜力，益生菌菌体上清液cps4通过激活nrf2抗氧化通路降低了lc3蛋白的表达，自噬体数量和ros水平，缓解afb1诱导的睾丸细胞毒性，提高精子数量和活力。本专利技术为益生菌在afb1诱导的生精障碍中的作用提供了新证据。
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1.一种复合益生菌，其特征在于：由干酪乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌组成，其中三种菌的活菌数均为1.0×105 CFU/mL，该复合益生菌对AFB1体外降解率为40.55%。
2.利用权利要求1复合益生菌制备的菌体上清液，其特征在于：在上清液和TM4细胞共同孵化时，当复合上清液中菌体浓度为1.0×104 CFU/mL时，细胞活力为116.86%。
3.如权利要求1所述的复合益生菌通过介导Nrf2抗氧化通路降低黄曲霉毒素B1诱导的TM4细胞自噬通量，用于制备治疗由AFB1诱导的生殖障碍的药物中。
4.如权利要求2所述的菌体上清液通过激活Nrf2抗氧化通路降低LC3B蛋白的表达，自噬体数量和ROS水平，缓解AFB1诱导的细胞毒性，用于制备治疗由AFB1诱导的生精障碍的药物中。
5.如权利要求1所述的复合益生菌，当复合益生菌中三种活菌数均为1.0×107 CFU/mL时，用于男性生精障碍药物中，改善150 μg/kg AFB1诱导的睾丸重量、睾酮水平和精子数量及活力降低的现象。
【技术特征摘要】
1.一种复合益生菌，其特征在于：由干酪乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌组成，其中三种菌的活菌数均为1.0×105 cfu/ml，该复合益生菌对afb1体外降解率为40.55%。
2.利用权利要求1复合益生菌制备的菌体上清液，其特征在于：在上清液和tm4细胞共同孵化时，当复合上清液中菌体浓度为1.0×104 cfu/ml时，细胞活力为116.86%。
3.如权利要求1所述的复合益生菌通过介导nrf2抗氧化通路降低黄曲霉毒素b1诱导的tm4细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：文秀华，刘太阳，李杰，李恩中，郭红伟，李云，李思强，谌馥佳，刘超英，
申请(专利权)人：驻马店市中心医院，
类型：发明
国别省市：
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