本发明专利技术涉及一种体细胞双尾彗星检测的方法，属于生物分子细胞实验技术领域。所述方法包括以下步骤：1)将细胞DNA损伤样品悬液与低熔点琼脂糖凝胶混匀得混合液，再将混合液点样到凝胶板样品孔中；2)将点样后的凝胶板浸入细胞裂解液中避光裂解；3)裂解后进行中性电泳；4)中性电泳结束后，凝胶板放入解旋液中，解旋后将凝胶板旋转90°，进行碱性电泳；5)往电泳后的凝胶板样品孔滴加DNA染色剂染色，在荧光显微镜下分析检测结果。本发明专利技术在原有精子双尾彗星检测的基础上，将研究对象扩展到体细胞，并根据精子与体细胞染色质结构差别，对实验条件进行优化，建立了一种体细胞双尾彗星检验的方法，用于在同一细胞内区分DNA双链断裂及DNA单链断裂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分子细胞实验，涉及一种体细胞双尾彗星实验方法。
技术介绍
1、单细胞凝胶电泳，又称彗星实验，是一种检测单细胞dna损伤的方法。于1984年，由ostling和johanson首次发表，至今已有接近40年的历史。彗星实验主要是利用高盐溶液裂解细胞，随后电泳，这时，断裂的dna片段会向阳极迁移，形成“彗星”尾，从而根据尾巴的大小判断dna损伤程度，即尾巴越大，dna损伤程度越高。目前，根据裂解和迁移条件的不同，分为碱性彗星实验与中性彗星实验。碱性彗星实验应用较广，用于鉴定dna单链断裂、dna双链断裂和碱不稳定位点，不能区分三者。中性彗星实验用于鉴定dna双链断裂。目前，彗星实验已经应用于基因毒性检测、生物及环境监测等领域。
2、内源或外源性因素会导致dna损伤，包括dna烷基化、氧化、错配、断裂等。其中dna单链断裂可以在细胞内迅速修复，而dna双链断裂后，原位重接的概率很小，染色体畸变发生概率高，可能会危及细胞存活。dna双链损伤被认为是最重要的染色质损伤，两个dsb的相互作用可能导致细胞死亡、癌变或突变。中性彗星检测虽然可以检测dna双链断裂，但是由于双链断裂产生的较少，通常需要一定的损伤才可以能使用，灵敏度较低。目前的彗星实验虽然可以通过改变电泳条件区分细胞单链断裂或双链断裂。然而，由于技术的局限性，无法在同一细胞中同时评估两种dna断裂类型。本专利技术在已有精子双尾彗星实验的基础上，改进裂解、电泳条件，建立了体细胞双尾彗星实验方法。
技术实现思路
>1、针对
技术介绍
中的问题，本专利技术提供了本专利技术的目的在于提供一种体细胞双尾彗星检测的方法。2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的一种体细胞双尾彗星检测的方法，包括以下步骤：
3、1)将细胞dna损伤样品悬液与低熔点琼脂糖凝胶混匀得混合液，再将混合液点样到凝胶板样品孔中；
4、2)将点样后的凝胶板浸入细胞裂解液中避光裂解；
5、3)裂解后进行中性电泳；
6、4)中性电泳结束后，凝胶板放入解旋液中，解旋后将凝胶板旋转90°，进行碱性电泳；
7、5)往电泳后的凝胶板样品孔滴加dna染色剂染色，在荧光显微镜下分析检测结果。
8、在步骤1)中，所述细胞样品浓度为1×105/ml；所述低熔点琼脂糖凝胶的质量分数为1％；所述细胞dna损伤样品悬液与低熔点琼脂糖凝胶的体积比可为1:3；所述凝胶板可采用24孔或96孔细胞培养板的板盖，所述板盖上的凹陷可用作样品孔。
9、在步骤2)中，裂解液配方为2.5m nacl，100mm edta-2na，10mm tris，用前加入1％triton x-100 10％ dmso，ph＝8.0；所述细胞裂解液在使用之前进行4℃预冷；所述裂解的条件可为：温度4℃，时间1h；所述裂解完成后可用tbe洗涤凝胶板1-3次，每次5min。
10、在步骤3)中，所述中性电泳的条件可为：温度4～10℃，避光，时间25min，电压28v。
11、在步骤4)中，所述解旋的条件可为：温度4℃，时间10min；所述电泳的条件为：温度4℃，时间10min，电压25v；所述电泳完成后可用tris缓冲液洗涤凝胶板1～3次，每次5～10min；所述解旋液、电泳液的配方为1mmol/l edta-2na，300mmol/l naoh，ph＞13。
12、在步骤5)中，所述的dna染色条件为，避光，7.5μg/ml pi，染色时间为5min。
13、本专利技术的有益效果在于，与现有单细胞凝胶电泳技术相比，本专利技术具有如下优点：
14、在同一体细胞中，同时观察dna单、双链断裂。常规实验无法区分这两种损伤
15、改进了精子细胞双尾彗星检验的裂解液配方，去掉了对人体有害的dtt(二硫苏糖醇)，仅用高盐条件对细胞进行裂解。
16、本专利技术可用24孔或96孔细胞培养板的板盖作为凝胶板代替载玻片用于单细胞凝胶电泳，使得本专利技术的样品制备工艺简单，容易操作，成功率高，提高了分析样品的数量。
本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述细胞样品浓度为1×105/mL，所述低熔点琼脂糖凝胶的质量分数为1％。
3.根据权利要求2所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述细胞DNA损伤样品悬液与低熔点琼脂糖凝胶的体积比为1:3。
4.根据权利要求3所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述凝胶板采用24孔或96孔细胞培养板的板盖，所述板盖上的凹陷用作样品孔。
5.根据权利要求1所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤2)中，裂解液配方为2.5M NaCl，100mM EDTA-2Na，10mM Tris，用前加入1％Triton X-100 10％DMSO，pH＝8.0；所述细胞裂解液在使用之前进行4℃预冷。
6.根据权利要求1所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述裂解的条件可为：温度4℃，时间1h；所述裂解完成后用TBE洗涤凝胶板1-3次，每次5min。
7.根据权利要求1所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述中性电泳的条件可为：温度4～10℃，避光，时间25min，电压28V。
8.根据权利要求1所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述解旋的条件可为：温度4℃，时间10min；所述电泳的条件为：温度4℃，时间10min，电压25V。
9.根据权利要求8所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述电泳完成后用Tris缓冲液洗涤凝胶板1～3次，每次5～10min，所述解旋液、电泳液的配方为1mmol/L EDTA-2Na，300mmol/L NaOH，pH＞13。
10.根据权利要求1所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤5)中，所述的DNA染色条件为，避光，7.5μg/mL PI，染色时间为5min。
...
【技术特征摘要】
1.一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述细胞样品浓度为1×105/ml，所述低熔点琼脂糖凝胶的质量分数为1％。
3.根据权利要求2所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述细胞dna损伤样品悬液与低熔点琼脂糖凝胶的体积比为1:3。
4.根据权利要求3所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述凝胶板采用24孔或96孔细胞培养板的板盖，所述板盖上的凹陷用作样品孔。
5.根据权利要求1所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于，在步骤2)中，裂解液配方为2.5m nacl，100mm edta-2na，10mm tris，用前加入1％triton x-100 10％dmso，ph＝8.0；所述细胞裂解液在使用之前进行4℃预冷。
6.根据权利要求1所述的一种体细胞双尾彗星检测的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：李琳，原雅艺，董娟聪，程娇，刘红艳，崔双双，左雅慧，党旭红，
申请(专利权)人：中国辐射防护研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。