【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸检测，主要涉及一种基于rpa-udg与cas12a联用的snp分型方法及应用。
技术介绍
1、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性，是人类可遗传的变异中最常见的一种。snp与许多生物过程密切相关，如遗传病、肿瘤发生、药物代谢，snp检测在药物基因组学、诊断和生物医学研究中至关重要。载脂蛋白e(apolipoprotein e，apoe)是一种两亲性可交换脂蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，在胆固醇转运和内化中起关键作用。人类apoe基因位于染色体19号染色体上，由rs429358和rs7412的单核苷酸多态性组合产生三个等位基因，分别为apoe2、apoe3和apoe4。e3最常见，约70％的人群为e3携带者。94.4％的iii型高脂蛋白血症患者携带e2纯合子。apoe4是与阿尔茨海默病关联性最强的遗传风险，携带一个apoe4等位基因(e2/e4或e3/e4)使阿尔茨海默病风险增加3-4倍，两个基因(e4/e4)则增加8-12倍。随着精准医学的快速发展，apoe基因分型在血脂异常和痴呆的诊断与个体化精准治疗中具有重要意义。
2、常用的snp检测方法可分为dna基因组测序方法(全基因组测序和靶向基因测序)和基于pcr的方法(等位基因特异性pcr(aspcr)和高分辨率熔化曲线(hrm)分析)。但是这些方法由于设备专业、自动化难度大、耗时长、价格相对昂贵等原因，难以广泛应。而crispr-a
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于rpa-udg与cas12a联用的snp分型方法及应用，用于解决现有方法检测成本高，通用性差，灵敏度低且特异性不强等问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种基于rpa-udg与cas12a联用的snp分型方法，包括以下步骤：
3、s1.rpa-udg：在扩增体系中，将目标核酸的反向引物中的脱氧胸苷替换为脱氧尿嘧啶，联合所述目标核酸的正向引物对目标dna序列进行扩增，得到扩增产物，然后利用尿嘧啶-dna-糖基化酶(udg)对所述扩增产物的du碱基进行酶切，得到dsdna靶标，所述dsdna靶标上具有可以跟sgrna进行tsdr的锚点区域；
4、扩增体系包括：目标dna序列，重组酶聚合酶干粉，正向引物，反向引物，udg蛋白。
5、s2.cas12a检测：构建cas12a检测体系，所述cas12a检测体系包括cas12a、sgrna、调控链、ssdna荧光底物和步骤s1得到的dsdna靶标；在所述cas12a检测体系中，利用sgrna触发tsdr，进而激活cas12a的反式切割活性，降解所述ssdna荧光底物，产生荧光信号；
6、s3.对所述荧光信号进行测定，实现对所述目标核酸的snp分型。
7、本专利技术还提供了一种上述的snp分型方法在apoe基因分型中的应用。
8、本专利技术还提供了一种apoe基因的spn分型检测方法，包括如下步骤：
9、s1.rpa-udg：在扩增体系中，将目标核酸的反向引物中的脱氧胸苷替换为脱氧尿嘧啶，联合所述目标核酸的正向引物对目标dna序列进行扩增，得到扩增产物，然后利用尿嘧啶-dna-糖基化酶对所述扩增产物的du碱基进行酶切，得到dsdna靶标，所述dsdna靶标上具有可以跟sgrna进行tsdr的锚点区域；
10、所述目标核酸为apoe基因的rs7412位点，c碱基为野生型碱基，t碱基为突变型碱基，共有三种基因型：野生型c/c，杂合型c/t，纯合突变型t/t；
11、所述野生型c/c的标准序列如seq id no：1所示；
12、所述纯合突变型t/t的标准序列如seq id no：2所示；
13、所述正向引物序列如seq id no：3所示；
14、所述反向引物序列如seq id no：4所示；
15、优选的，所述扩增体系中，正向引物和反向引物浓度均为600nm。
16、优选的，udg浓度为5u/μl，在1×udg reaction buffer缓冲溶液中，50℃条件下，反应10分钟。
17、s2.cas12a检测：构建cas12a检测体系，所述cas12a检测体系包括cas12a、sgrna、调控链、ssdna荧光底物和步骤s1得到的dsdna靶标；在所述cas12a检测体系中，利用sgrna触发tsdr，进而激活cas12a的反式切割活性，降解所述ssdna荧光底物，产生荧光信号；具体的，将反应完后的溶液加入比色皿中，在荧光分光光度计中采集荧光信号。
18、所述sgrna为如seq id no：5所示序列的sgrna-wt或如seq id no：6所示序列的sgrna-mutant；
19、所述调控链为野生型调控链或突变型调控链；
20、所述野生型调控链的序列如seq id no：7所示；
21、所述突变型调控链的序列如seq id no：8所示；
22、优选的，cas12a检测体系中，sgrna、cas12a和调控链的浓度分别为60nm、20nm和50nm。
23、优选的，cas12a检测的条件为39℃，反应40分钟。
24、s3.对所述荧光信号进行测定，实现对所述目标核酸的snp分型。具体的，通过两种sgrna测得的信号比值进而获得目标序列的基因型。
25、与现有技术相比，本专利技术首次将rpa-udg与cas12a反应体系结合，通过对rpa扩增步骤的改进，得到了可以跟cas12a体系进行连置换反应的扩增产物，扩增过程无需温度循环，避免了精密贵重仪器的需求，简化了测定条件和步骤，同时保证了高灵敏度和特异性，对目标序列不再受到pam结构域的限制，使得该方法具有更强通用性。
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1.一种基于RPA-UDG与Cas12a联用的SNP分型方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.权利要求1所述的SNP分型方法在ApoE基因分型中的应用。
3.一种ApoE基因的SPN分型检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的SPN分型检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述扩增体系中，正向引物和反向引物浓度均为600nM。
5.根据权利要求3所述的SPN分型检测方法，其特征在于，步骤S1中，步骤S1中，UDG浓度为5U/μL，在1×UDG Reaction Buffer缓冲溶液中，50℃条件下，反应10分钟。。
6.根据权利要求3所述的SPN分型检测方法，其特征在于，所述Cas12a检测体系中，sgRNA、Cas12a和调控链的浓度分别为60nM、20nM和50nM。
7.根据权利要求3所述的SPN分型检测方法，其特征在于，所述Cas12a检测的条件为39℃，反应40分钟。
【技术特征摘要】
1.一种基于rpa-udg与cas12a联用的snp分型方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.权利要求1所述的snp分型方法在apoe基因分型中的应用。
3.一种apoe基因的spn分型检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的spn分型检测方法，其特征在于，步骤s1中，所述扩增体系中，正向引物和反向引物浓度均为600nm。
5.根据权利要求3所述的spn分型检测方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：于艳艳，苏高星，朱越东，张艳，林亚男，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：
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