【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，具体地说，涉及一种青霉素酰胺酶及其用于合成头孢克洛的方法。
技术介绍
1、青霉素酰胺酶，又称青霉素g酰化酶(penicillin g amidase，e.c.3.5.1.11，简称pga)是制备半合成β-内酰胺类抗生素中的重要用酶，该酶主要用于水解合成6-氨基青霉烷酸(6-apa)、7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-adca)等；同时pga还可用于催化母核6-apa、7-adca、7-acca等与各种d-氨基酸侧链反应生成新的半合成β-内酰胺抗生素。另外，青霉素酰胺酶在一些手性化合物合成过程中可以用于保护羟基和氨基、拆分手性化合物等。但目前针对pga水解性能应用报道相对较多，研究焦点大部分集中在其酶活性的提升。在制药工业中，酶催化反应的实际工艺涉及到多个方面，包括比活力、选择性、底物/产物抑制性、ph、温度、稳定性等。
2、头孢克洛(cefaclor)化学名为(6r,7r)-7-[(r)-2-氨基-2-苯基乙酰胺基]-3-氯-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸一水合物，1975年由美国礼来公司研发，1982年作为第二代头孢菌素在美国上市，其抗菌谱较宽，对肺炎球菌、化脓性链球菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌和肺炎杆菌、流感嗜血杆菌、淋病双球菌、厌氧菌等均具有良好的抗菌活性，是临床上常用的口服类头孢菌素，多年来一直是全球畅销口服头孢类抗生素。
3、头孢克洛目前有化学合成和酶法合成两种工艺，其中化学合成多采用酰氯法和混合酸酐法，反应步骤多，条件苛刻
4、
5、酶法工艺的反应步骤少，操作简单，无毒害，成本低、收率高，是一种具有良好应用前景的绿色合成技术，工业上已经逐步取代化学合成工艺。但目前工业上的pga对底物7-acca的合成活力相对较低，反应时间长，底物侧链比相对比较高，开发针对7-acca底物高合成活力的青霉素酰化酶成为该工业开发的重要方向。
6、专利技术人曾在专利cn105483105b中报道了无色杆菌achromobacter sp.ccm 4824来源的青霉素g酰化酶突变体具有催化7-acca和d-pgm.hcl合成头孢克洛的较好性能，合成活力较高。
技术实现思路
1、目前工业化实施的酶法合成头孢克洛工艺普遍存在如下缺陷：低ph时酶活力较低，反应时间长，底物苯甘氨酸酯盐不稳定自身水解严重；而高ph反应时头孢克洛和底物苯甘氨酸酯盐易水解。因此反应整体显示出底物转化率低，母核7-acca反应残留高、侧链苯甘氨酸酯盐的加量大等问题，因此需要开发对母核7-acca的底物亲和力(底物高浓度耐受性)更高、且在低ph(比如ph6.8或更低)条件下合成活力高的酶，用于改善酶法合成头孢克洛的工艺。我们对于更多微生物来源的青霉素酰胺酶种类进行了广泛筛选，比较它们的立体专一性、合成比活力、ph适用范围、s/h值(合成产物/水解产物比值、合成/水解比值)、热稳定性等工业生产工艺指标。通过对数十种微生物来源的野生型青霉素酰胺酶进行对比，发现一种来源于伊平屋海岭海洋芽孢杆菌(伊赫氏海洋芽孢杆菌，oceanobacillus iheyensis)的青霉素酰胺酶(uniprot序列号q8cx57)对催化底物7-acca与d-pgm.hcl反应生成头孢克洛时具有较好的促合成性能，合成/水解比值即s/h值(产物头孢克洛与副产品d型-苯甘氨酸(d-pg)的摩尔比)相对较高，立体专一性高，但是在低ph时的酶活力偏低，导致d-pgm和7-acca底物反应添加摩尔比一直较高。于是接着对该酶进行随机突变，还得到了一些酶活力进一步提高的突变体。基于该研究，本专利技术包括如下技术方案。
2、一种酶催化制备头孢克洛的方法，包括如下步骤：以7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-酸(7-acca)和d-苯甘氨酸甲酯盐酸盐(d-pgm.hcl)为底物，使用oceanobacillus iheyensis来源的青霉素酰胺酶(uniprot序列号q8cx57)或者其酶活力提高的突变体催化合成反应，得到头孢克洛。
3、其中，oceanobacillus iheyensis来源的野生型青霉素酰胺酶(uniprot序列号q8cx57)的氨基酸序列如seq id no:1所示：
4、mgerqreqvsqpkkkrrirtkkillgglgsifllaliaflfvngyinkslpqtegtmelpmldnevtvitdedgvphiqaetardmyiaqgyiqadrrmfqmelsrrqasgtlsevvgedalnqdkyfrtlglrraaeksyevyseesvevlewfstgvnaymeeakannslpveftlmdfepeewtpvdsltigkfmafdlgghwqqqafnyylldnyeqekayelfpsypenkptiiqdeeidiaasfehaviphpfngsnnwvvsgdktasgmplladdphlglatpsiwlqmhlesgdglnvsgvifagvpgiilghneqiawgvtntgpdvqqlyieqrnpdnpheflfedeweeatvmeepikvkdgetvdyevvetrhgpivsefasesgkdtvlslrwtaldasteleaimemnratgweefeqglekflvpaqnfvfasndgtiaykangkipiyedgqdallplngweaesewqgyipydelptvinpekgfiatannqiapdsypyhisnvwaqpyryeriaevlesgdnftaedmqdlqmdqtdlrarefvpifqkvledtelteqekealdalsewdfvadkdapqplifehwmqaiqstiyqqeipqvmrelfstqsqstenvlrkaasgqksqwiedkggievvlhdalentmekltetygedlsawkwgdyhqvqfhhplssvspllafflnnedaipvggsgvtpmatsydketgevdhgaswrfvidtsdmqsgyhivgpgqdghfrsdwyhdqmndwvegnfhetrldgaegeelvlepge(seq id no:1)。
5、优选地，所述突变体为选自下述的多肽：
6、(a)氨基酸序列为seq id no:3的多肽；
7、(b)氨基酸序列与seq id no:3有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比seq id no:3提高的多肽；
8、(c)氨基酸序列与seq id no:3有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且s/h值(合成产物/本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酶催化制备头孢克洛的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变体为选自下述的多肽：
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应温度为10～20℃；反应体系pH值为pH6.0-8.0。
4.一种青霉素酰胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
5.编码如权利要求4所述青霉素酰胺酶突变体SEQ ID NO:3的基因。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
7.一种DNA分子，其特征在于，包含如权利要求6所述的基因。
8.一种质粒，其特征在于，包含如权利要求7所述的DNA分子。
9.如权利要求8所述的质粒，其特征在于，质粒载体选自PET系列。
10.一种微生物，其表达如权利要求5所述的基因。
【技术特征摘要】
1.一种酶催化制备头孢克洛的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变体为选自下述的多肽：
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应温度为10～20℃；反应体系ph值为ph6.0-8.0。
4.一种青霉素酰胺酶突变体，其氨基酸序列为seq id no:3。
5.编码如权利要求4所述青霉素酰胺酶突变体seq ...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈舒明，
申请(专利权)人：上海康鑫化工有限公司，
类型：发明
国别省市：
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