【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种学龄前儿童哮喘诊断新生物标志物筛选方法和应用。
技术介绍
1、哮喘是儿童最常见的慢性疾病，其特征是气道高反应性、可逆性气道阻塞和慢性气道炎症，学龄前儿童的哮喘发病率和住院率高于老年人。肺功能轨迹在儿童期建立，与哮喘相关的气道重塑3岁前出现，因此，学龄前儿童是哮喘干预的关键时期，准确识别和诊断学龄前儿童的哮喘可能有助于了解哮喘症状和提高治疗依从性。由于哮喘症状是反复发作和波动的，其在儿童中的诊断仍然具有挑战性，并且有效的独立诊断测试很少。最近，美国国家健康与护理卓越研究所和asthma10-12全球倡议提出了结合可用测试的诊断算法，如肺活量测定、支气管扩张剂可逆性测试、测量支气管高反应性的支气管激发测试、呼出一氧化氮分数(feno)和过敏测试。然而，这些算法对学龄前儿童哮喘的诊断准确性尚不确。
2、因此，迫切需要更好的哮喘诊断方法。为了实现这一目标，需要新的研究来识别可以区分哮喘和健康学龄前儿童的生物标志物，随后可以将其纳入诊断算法。在哮喘中，某些与气道阻塞和炎症相关的蛋白质在组织细胞中产生，并分泌到循环系统中。因此，蛋白质组学是鉴定学龄前儿童哮喘潜在诊断生物标志物的一种有前途的方法。尽管蛋白质组学在以前的研究中已被用于分析哮喘患者的血液样本，但大多数使用数据依赖采集(dda)-质谱(ms)并集中于老年儿童或成人。数据独立采集(dia)-ms是一种时间上并行的采集方法，比dda具有更好的一致性和再现性，尤其适用于大样本群组蛋白质组学研究。
3、先前的研究已经确定了几种哮喘蛋白
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种学龄前儿童哮喘诊断新生物标志物筛选方法，使用orbitrap exploris 480平台对哮喘学龄前儿童进行了基于dia-ms的血清蛋白质组分析。结合生物信息学和统计分析，确定了与学龄前儿童哮喘相关的关键信号通路和生物标记蛋白。
2、基于上述技术思路，本专利技术采用的技术方案为：
3、本专利技术提供一种学龄前儿童哮喘诊断新生物标志物筛选方法，包括以下步骤：
4、步骤1：采用数据独立采集质谱分析受试者的血清蛋白质组特征，经过数据过滤后，确定急性哮喘组与健康对照组之间的差异表达蛋白质；
5、步骤3：急性哮喘组与健康对照组之间总共存在50个差异表达蛋白质，采用监督正交偏最小二乘判别分析模型分析上述差异表达蛋白在哮喘个体和健康儿童方面的潜在作用，筛选出mmp14、abhd12b、ltbp1、apoa1、ang和igfals蛋白作为区分哮喘儿童和健康儿童的生物标志物；
6、步骤4：采用tbtools绘制六个生物标志物的热图，并对六种差异表达蛋白进行受试者操作特征曲线分析，评估六个生物标志物在区分哮喘个体和健康儿童中的敏感性和特异性。
7、优选的，在步骤1中受试者包括急性哮喘组、哮喘恢复期组和健康对照组，受试者的血清蛋白质组提取过程如下：
8、(1)受试者未经药物治疗前采集血样，在室温下避光放置1小时，然后在4℃下以3000rpm的速度离心15分钟，分离血清，最后，将血清等分并储存在80℃的冰箱中；
9、(2)蛋白质提取和胰蛋白酶消化
10、首先，将血清样品在4℃下以12000g离心10分钟，以去除细胞碎片，然后，保留上清液，使用bca试剂盒测定血清的蛋白质浓度，然后，在56℃下用5mm二硫苏糖醇还原血清蛋白溶液30分钟，并在黑暗的室温下用11mm碘乙酰胺烷基化15分钟，第一次过夜消化以1∶5的比例加入胰蛋白酶，第二次4小时消化以1∶100的比例加入，使用c18 ziptips对消化的肽进行脱盐，用溶于50–70％乙腈中的0.1％ tfa洗脱，然后冻干并重新溶解于1％甲酸5％乙腈中；
11、(3)高ph值-反相分馏
12、经处理的肽溶液等量合并，并通过高ph-反相分离进一步分离，使用dionex uhplc和乙烯桥杂交c18柱，在40℃下，以0.2毫升/分钟的流速和60分钟的acn梯度在5mm甲酸铵中进行；以1分钟的间隔收集级分，并汇集成12个级分，然后，将每个组分冻干并重新溶解在1％甲酸5％乙腈中。
13、本专利技术另一目的是提供一种诊断学龄前儿童哮喘的生物标志物组合物，该组合物包括ltbp1、apoa1和igfals蛋白。
14、本专利技术又一目的是提供一种诊断学龄前儿童哮喘的新生物标志物组合物在制备用于血清诊断受试者中哮喘患者的试剂中的应用。
15、本专利技术的有益效果：
16、本专利技术采用数据独立采集质谱(dia-ms)分析了急性哮喘儿童和恢复期儿童的血清蛋白质组特征，在46份血清中鉴定了50种差异表达的蛋白质，这些蛋白质区分了哮喘儿童和健康儿童，并通过对差异表达的蛋白质进行功能富集分析，证实了炎症-免疫机制在哮喘发病中的中心作用，并建立监督正交偏最小二乘判别分析(opls-da)模型，经过200次排列测试后，opls-da哮喘模型和健康对照的r 2和q2分别为0.53和0.45，opls-da哮喘模型和健康对照的r2和q2分别为0.766和0.491。表明模型拟合良好，具有可靠的预测能力。从而利用上述模型筛选出mp14、abhd12b、ltbp1、apoa1、ang和igfals蛋白作为生物标志物。
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1.一种学龄前儿童哮喘诊断新生物标志物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种学龄前儿童哮喘诊断模型的建立方法，其特征在于，在步骤1中受试者包括急性哮喘组、哮喘恢复期组和健康对照组，受试者的血清蛋白质组提取过程如下：
3.一种诊断学龄前儿童哮喘的生物标志物组合物，其特征在于，该组合物包括LTBP1、APOA1和IGFALS蛋白。
4.一种诊断学龄前儿童哮喘的生物标志物组合物在制备用于血清诊断受试者中哮喘患者的试剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种学龄前儿童哮喘诊断新生物标志物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种学龄前儿童哮喘诊断模型的建立方法，其特征在于，在步骤1中受试者包括急性哮喘组、哮喘恢复期组和健康对照组，受试者的血清蛋白质组提取...
【专利技术属性】
技术研发人员：张国成，丁辉，石曌玲，李如英，林海波，张志红，孙媛，付琳，程小宁，高奶荣，叶佳鑫，马文娟，
申请(专利权)人：陕西中医药大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：
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