一种dsRNA及其提取方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，公开了一种从大肠杆菌中产生dsRNA以抑制灰霉菌的方法及dsRNA的提取方法和应用。本发明专利技术公开的RNAi的靶标基因是灰葡萄孢菌中的BcSAS1，因为它在灰霉病菌的毒力中发挥关键作用。具体来说，BcSAS1编码灰霉菌中菌丝发育和毒力所需的小GTP酶Rab家族的成员。本发明专利技术以灰霉菌BcSAS1基因为基础，获得的dsRNA能有效降低灰霉菌的侵染能力从而防控植物和水果的灰霉病。本发明专利技术利用大肠杆菌实现了在短时间内大规模合成dsRNA，并显著提高了dsRNA的提取效率，克服现有技术难以大规模生产dsRNA的缺点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种dsrna及其提取方法和应用，属于防治农业真菌病害灰霉病的rna生物农药领域。

技术介绍

1、灰葡萄孢菌，又称灰霉菌(botrytis cinerea)，是最重要的农业经济植物病原菌之一，可导致包括许多水果和叶菜在内的1000多种植物发生灰霉病，每年给全球造成的经济损失(超过100亿美元)巨大。由于其寄主范围广、遗传变异快、抗逆性强，导致灰霉病很难控制。迄今为止，针对采后疾病最有效的治疗方法是使用杀菌剂。然而，杀菌剂也有一些缺点，例如存在产生抗杀菌剂真菌的风险。此外，由于它们缺乏特异性，它们对环境中的有益微生物构成潜在威胁，包括对人类健康的影响。因此，需要开发生态友好的方法来控制真菌病原体和采后疾病。

2、据报道，诱导rna干扰(rnai)的小干扰rna(sirna)参与了宿主免疫和病原体毒力。与此同时，b.cinerea可利用sirna效应器和宿主rnai机制来促进灰霉病在宿主物种中的发展。因此，使用双链rna(dsrna)靶向重要真菌基因的基于rnai的生物杀真菌剂被认为是一种控制毁灭性灰霉病的新兴方本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种dsRNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的固定液为无水乙醇和磷酸盐缓冲液的混合溶液，固定液中乙醇的浓度为60～80％v/v；

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的经固定液和盐溶液处理，将所述的含有dsRNA的发酵液离心得到沉淀，重悬于所述的固定液中，离心，再重悬于所述的盐溶液中，60～100℃孵育5～30min，离心收集上清得到粗提dsRNA。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的含有dsRNA的发酵液按照如下方...

【技术特征摘要】

1.一种dsrna的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的固定液为无水乙醇和磷酸盐缓冲液的混合溶液，固定液中乙醇的浓度为60～80％v/v；

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的经固定液和盐溶液处理，将所述的含有dsrna的发酵液离心得到沉淀，重悬于所述的固定液中，离心，再重悬于所述的盐溶液中，60～100℃孵育5～30min，离心收集上清得到粗提dsrna。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的含有dsrna的发酵液按照如下方法制备：制备重组表达载体并导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；将所述的重组大肠杆菌发酵培养即得。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述的重组表达载体的制备方法为...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳东，鲍雅楠，张迪，廖镜淋，张斌赟，李飞雪，刘霖洁，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：