【技术实现步骤摘要】
本专利技术是申请号为2022113822935申请案的分案申请，申请日为2022年11月07日。本专利技术涉及疫苗制备方法领域，具体涉及seov的gn区亚单位疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
1、目前，关于汉坦病毒的疫苗，仅在我国和韩国有汉滩病毒(hantaan virus,，htnv)和汉城病毒(seoul viru,s，seov)的全病毒灭活疫苗上市，欧美国家至今尚无临床可用的疫苗，并且该类灭活疫苗诱导机体产生中和抗体的能力较弱，细胞免疫应答欠佳，维持时间短等缺点并存在一定的副作用及安全性隐患。
2、在汉坦病毒新型基因工程疫苗的国内外基础研究中，主要是针对单一病毒型进行设计。在国外，研发汉坦病毒核酸疫苗、病毒载体疫苗等多种形式的备选疫苗方面有显著进展，部分已进入临床i期。在国内，针对htnv的核酸疫苗、病毒样颗粒(vlp)疫苗、亚单位疫苗等方向也取得一定进展。尽管利用汉坦病毒包膜糖蛋白(gn和和gc)作为抗原组分进行设计的研究已取得长足进展，但均是针对htnv、puuv等等单一型别病毒，目的蛋白表达量较低，距离实际应用还有差距。进一步对汉坦病毒进行创新研究，设计、优化、组合有效的保护性抗原，选择合适的表达载体并优化表达系统，以提高目的基因产物刺激机体免疫应答的能力，都值得深入探索。
3、现有肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,，hfrs)上市疫苗为全病毒灭活疫苗，该类疫苗引起机体的免疫应答偏弱、保护效价偏低，并存在一定副作用及生物安全隐患。在目
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了seov的gn区亚单位疫苗及其制备方法和应用，所述亚单位疫苗稳定性好、易于纯化、不含病毒核酸成分，安全性较高，是一种可预防流行的汉坦病毒感染的通用疫苗。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
3、s1，共有序列设计：根据汉滩病毒和汉城病毒m基因高度同源性优势，运用生物信息学方法，获得1条汉滩病毒包膜糖蛋白共有序列，如seq id no.1所示，获得1条汉城病毒包膜糖蛋白共有序列，如seq id no.2所示，然后，结合公共数据库已知汉滩及汉城病毒包膜糖蛋白gn和gc的基因序列信息，去除其中的滞留信号tm，分别提取汉滩病毒和汉城病毒的gn和gc基因序列的共有序列；
4、s2，目的基因重组质粒的构建：以包膜糖蛋白共有序列为模板，引入限制性内切酶酶切位点和c端凝血酶切割位点，以高保真dna聚合酶进行pcr扩增获得产物，然后将产物进行双酶切消化，分别与已酶切的s2细胞表达载体pmt/bip/v5-his-a连接，连接产物转化筛选获得目的基因重组质粒；
5、s3，目的蛋白的表达、纯化：将重组质粒转染s2细胞，筛选阳性细胞，诱导蛋白表达，将稳定表达重组蛋白的s2细胞系扩大培养，诱导蛋白表达并纯化，获得通用亚单位疫苗。
6、进一步地，s1中，根据ncbi数据库中已发表的166条汉滩病毒包膜糖蛋白序列(1135个氨基酸)和98条汉城病毒包膜糖蛋白序列(1133个氨基酸)，基于序列比对分析结果，以每个位点出现频率大于50％的氨基酸残基作为候选序列。其中，由于汉滩病毒包膜蛋白354位和359位存在高变异率，分别以两位点最保守的氨基酸残基g354(35％同源性)和m359(45％同源性)作为目标序列获得完整的包膜糖蛋白共有序列。
7、进一步地，s2中，转化过程为：将连接产物转化至top10大肠杆菌感受态，通过amp抗性筛选，获得成功构建的重组质粒。
8、进一步地，s3中，转染过程具体为：将包含汉滩病毒或汉城病毒gn头部区、gn膜外区和gc膜外区共有序列的6个重组质粒分别与筛选质粒pcoblast以19:1的质量比混合，通过cacl2转染试剂共转染至果蝇s2细胞中，置于28℃无co2的培养箱孵育。
9、进一步地，s3中，诱导蛋白表达所用试剂为终浓度为10μm的cdcl2。
10、进一步地，s1中，所述的汉滩及汉城病毒包膜糖蛋白gn和gc的基因序列信息均从公共数据库中获取。
11、本专利技术的第二个目的是提供一种所述的制备方法制备得到的汉坦病毒亚单位疫苗。
12、本专利技术的第三个目的是提供所述的亚单位疫苗在制备预防汉坦病毒感染的疫苗注射剂中的应用。
13、进一步地，所述疫苗为基因工程疫苗。
14、进一步地，所述疫苗不含病毒核酸成分。
15、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
16、1、本专利技术采用htnv和seov m基因共同保守区域序列设计疫苗，获得可预防我国流行的汉坦病毒感染的通用疫苗
17、2、本专利技术在蛋白序列的设计中，去除htnv及seov胞膜糖蛋白gn和gc基因滞留信号tm，增加蛋白可溶性，提高亚单位蛋白疫苗产量。
18、3、本专利技术制备得到的亚单位疫苗具有稳定性好、易于纯化的优点，不含病毒核酸成分，安全性较高。
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1.汉城病毒包膜糖蛋白Gn区亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，根据NCBI数据库中已发表的166条汉滩病毒包膜糖蛋白序列和98条汉城病毒包膜糖蛋白序列，基于序列比对分析结果，以每个位点出现频率大于50％的氨基酸残基作为候选序列，其中，由于汉滩病毒包膜蛋白354位和359位存在高变异率，分别以两位点最保守的氨基酸残基G354和M359作为目标序列获得完整的包膜糖蛋白共有序列。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S2中，转化过程为：将连接产物转化至TOP10大肠杆菌感受态，通过Amp抗性筛选，获得成功构建的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S3中，转染过程具体为：将包含汉滩病毒或汉城病毒Gn头部区、Gn膜外区和Gc膜外区共有序列的6个重组质粒分别与筛选质粒pcoblast以19:1的质量比混合，通过CaCl2转染试剂共转染至果蝇S2细胞中，置于28℃无CO2的培养箱孵育。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S3中，诱导蛋
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述的汉滩及汉城病毒包膜糖蛋白Gn和Gc的基因序列信息均从公共数据库中获取。
7.权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的汉城病毒亚单位疫苗。
8.权利要求7所述的亚单位疫苗在制备预防汉城病毒感染的疫苗注射剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗为基因工程疫苗。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗不含病毒核酸成分。
...【技术特征摘要】
1.汉城病毒包膜糖蛋白gn区亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s1中，根据ncbi数据库中已发表的166条汉滩病毒包膜糖蛋白序列和98条汉城病毒包膜糖蛋白序列，基于序列比对分析结果，以每个位点出现频率大于50％的氨基酸残基作为候选序列，其中，由于汉滩病毒包膜蛋白354位和359位存在高变异率，分别以两位点最保守的氨基酸残基g354和m359作为目标序列获得完整的包膜糖蛋白共有序列。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，s2中，转化过程为：将连接产物转化至top10大肠杆菌感受态，通过amp抗性筛选，获得成功构建的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，s3中，转染过程具体为：将包含汉滩病毒或汉城病毒gn头部区、gn膜外区和gc...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴兴安，刘蓉蓉，束佳熠，刘梓谕，吕云华，孙雯洁，应旗康，侯诗源，王芳，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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