【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养，具体涉及一种细胞培养替代血清培养液及方法。
技术介绍
1、糖尿病及并发症已经成为严重危害我国人民健康的公共卫生问题。目前，流行病学调查显示我国糖尿病患病率已高达12.8%，而血糖控制不佳导致的心脑血管疾病、慢性肾脏病、眼底病变及糖尿病足等并发症是导致糖尿病患者死亡或致残的主要原因，给国民健康和社会经济带来沉重负担。尽管目前的治疗糖尿病药物的选择很多，但主要是针对糖尿病期的血糖控制，对从血糖正常到糖尿病前期及糖尿病的进展的预防性措施办法不多。就目前来说，胰岛干细胞移植则是一个比较理想的根治糖尿病的方法。但是对于体外大规模培养胰岛干细胞所使用的培养基中添加的异源血清，大大增加了移植过程中人体排异反应的风险。
2、无血清培养基是指在基础培养基中通过添加添加剂来替代异源血清，从而降低异源血清对细胞的影响。由于传统哺乳动物细胞培养液除了需要使用dmem(dulbecco'smodified eagle med ium)培养基或mem(minimum eagle's medium)培养基等作为基础培养基外，还需要往基础培养基中添加10％左右的胎牛血清或小牛血清。对人工培养细胞来说，血清主要作用包括提供基本营养物质；提供激素和各种生长因子；提供结合蛋白；提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤；对培养中的细胞起到某些保护作用。但是使用血清作为添加剂也存在一些问题，比如存在血清用量大、成本高等问题，还有血清中含有一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能反应产生有毒性作用的聚精胺等等。另外，血清因为来源、加
3、目前，关于无血清培养液也有相当数量的文献公开，例如，专利200710057738.1中公开了一种无血清或低血清浓度的细胞培养方法，包括如下步骤：用含容积比为0~1％的血清培养液，在高于1个标准大气压10~180mmhg的压力下培养细胞20~50h，该专利的关键是利用应压力代替较高浓度的血清，细胞在无血清或低血清和一定应压力的条件下生长。又如，专利201110303107.x中公开了一种用于哺乳动物唾液腺上皮细胞和唾液腺干细胞培养的无血清培养液，该培养液是以mcdb153haa为基础培养基，并添加氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲液、激素类化合物、转金属蛋白、抗氧化剂、血清白蛋白、糖类、嘌呤、嘧啶碱类物质以及ph值指示剂制成。目前的无血清培养液主要是通过添加氨基酸、维生素、嘌呤等与血清相似的营养组成的物质来替代血清的作用，但是由于这些化合物存在不稳定的因素，同时由于无血清培养基具有特异性，即针对不同的细胞，其培养基的组成成分也是不一样的，没有广泛的适应性。
4、因此，开发一种针对胰岛样细胞的无血清培养液的也是目前需要研究的方向。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在针于对现有技术中的缺陷，提供一种细胞培养替代血清培养液及方法。本专利技术的培养液培养胰岛细胞能够有效提高细胞的增殖能力，提高具有分化功能的胰岛干细胞的数量，且未专利技术的培养液不添加血清，从而避免了异源血清对细胞的影响。
2、本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
3、本专利技术的一个方面提供了一种细胞培养替代血清的培养液，该培养液由基础培养液和外源添加物组成，所述基础培养液为dmem培养液或f12培养液或dmem培养液与f12培养液按照体积比为1:2的混合培养液；所述外源添加物为必需补充因子、细胞生长因子、微载体、微载体助剂、孕酮以及ph调节剂；其中，
4、所述微载体的制备方法如下：将明胶和聚乳酸-羟基乙酸共聚物按照质量比1:2~5的量混合得到混合物然后将混合物溶于体积分数为40~50%四氢呋喃中，之后将整个反应体系升温至60~85℃，并保温60~100min，然后降至40~50℃，加入三维有序大孔金属-有机框架材料保温3~8h，最后将体系降至室温后过滤，将所得固体产物依次经-50~-30℃冷冻干燥后再于40~50℃真空恒温干燥箱中干燥，最后将产物研磨至粒径在100~500μm的颗粒物即为微载体；
5、所述微载体助剂的制备方法如下：先将淀粉和水按照质量体积比1mg：1~3ml的量比放入反应釜中，进行加热搅拌溶解当温度达到糊化温度时，边搅拌边依次加入离子液体和金属化合物，当全部加入完毕后将体系升温至40~60℃后继续搅拌8~10h，最后经过喷雾干燥、研磨得到改性淀粉粉末，将所得改性淀粉粉末超声分散于水中并调节溶液ph=7得到浓度在30~50wt%的改性淀粉溶液即为微载体助剂；
6、上述反应过程中三维有序大孔金属-有机框架材料的加入量为明胶和聚乳酸-羟基乙酸共聚物总质量的0.5~1倍；
7、上述反应过程中离子液体、金属化合物与淀粉按照0.03~0.06ml：0.4~0.8mg：1g的量加入。
8、进一步地，所述三维有序大孔金属-有机框架材料选自3dom-pcn-601、3dom-pcn-14、3dom-zif-8、3dom-zif-67、3dom-zif-68、3dom-zif-69、3dom-zif-70、3dom-zif-78、3dom-zif-81、3dom-zif-82、3dom-zif-95、3dom-zif-100、3dom-uio-66中的一种或两种以上的混合物。
9、进一步地，所述离子液体选自选自1,2-二甲基-3-乙氧基乙基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-甲基-3-乙氧基乙基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、n-丁基-n-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐、1-甲基-3-乙氧基甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、n-乙氧基甲基-n-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐、1-甲基-3-丁基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、n-乙氧基乙基-n-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐、n,n-二乙基-2-甲氧基乙基-n-甲基胺双三氟甲磺酰亚胺盐中的任一种。
10、进一步地，所述金属化合物选自由以下金属元素组成的组中的任一种或者多种的氯化物，该组组成为：锌、铜、钠、钾、钙、镁、铁、锰、铬、钼、钴、镍、钒、锡。
11、进一步地，所述微载体的浓度为1~3g/l；所述微载体助剂的浓度为10~50ml/l。
12、进一步地，所述必需补充因子为浓度为5-30mg/l的胰岛素和浓度为10~20mg/l的转铁蛋白；所述生长因子包括表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素生长因子和碱性成纤维生长因子，其中，所述表皮生长因子的浓度为15~25mg/l、所述神经生长因子的浓度为20~30mg/l、所述胰岛素生长因子的浓度为15~25mg/l和所述碱性成纤维生长因子的浓度为10~30mg/l；所述孕酮的浓度为3~5mmol/l；所述ph调节剂调节培养液ph为6.9~7.3。
13、本专利技术的目的及解决其技术问题还通过采用以下技术方案来实现。
14、本专利技术的另一个方面还提供了一种胰岛干细胞的培养方法，采用前述的细胞培养替代血清的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞培养替代血清的培养液，该培养液由基础培养液和外源添加物组成，其特征在于，所述基础培养液为DMEM培养液或F12培养液或DMEM培养液与F12培养液按照体积比为1:2的混合培养液；所述外源添加物为必需补充因子、细胞生长因子、微载体、微载体助剂、孕酮以及pH调节剂；其中，
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述三维有序大孔金属-有机框架材料选自3DOM-PCN-601、3DOM-PCN-14、3DOM-ZIF-8、3DOM-ZIF-67、3DOM-ZIF-68、3DOM-ZIF-69、3DOM-ZIF-70、3DOM-ZIF-78、3DOM-ZIF-81、3DOM-ZIF-82、3DOM-ZIF-95、3DOM-ZIF-100、3DOM-UIO-66中的一种或两种以上的混合物。
3.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述离子液体选自选自1,2-二甲基-3-乙氧基乙基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-甲基-3-乙氧基乙基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、N-丁基-N-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐、1-甲基-3-乙氧基甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、N-乙
4.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述金属化合物选自由以下金属元素组成的组中的任一种或者多种的氯化物，该组组成为：锌、铜、钠、钾、钙、镁、铁、锰、铬、钼、钴、镍、钒、锡。
5.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述微载体的浓度为1~3g/L；所述微载体助剂的浓度为10~50mL/L。
6.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述必需补充因子为浓度为5-30mg/L的胰岛素和浓度为10~20mg/L的转铁蛋白；所述生长因子包括表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素生长因子和碱性成纤维生长因子，其中，所述表皮生长因子的浓度为15~25mg/L、所述神经生长因子的浓度为20~30mg/L、所述胰岛素生长因子的浓度为15~25mg/L和所述碱性成纤维生长因子的浓度为10~30mg/L；所述孕酮的浓度为3~5mmol/L；所述pH调节剂调节培养液pH为6.9~7.3。
7.一种胰岛干细胞的培养方法，其特征在于，采用权利要求1~6中任一项所述的培养液进行培养，所述培养方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S3中在加入微载体助剂之后的6~8h内还加入浓度均为1~10 mmol/L的维甲酸和白藜芦醇。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述胰腺细胞的制备方法为：将胰腺组织以四型胶原酶消化后以PBS洗涤制得胰腺细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种细胞培养替代血清的培养液，该培养液由基础培养液和外源添加物组成，其特征在于，所述基础培养液为dmem培养液或f12培养液或dmem培养液与f12培养液按照体积比为1:2的混合培养液；所述外源添加物为必需补充因子、细胞生长因子、微载体、微载体助剂、孕酮以及ph调节剂；其中，
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述三维有序大孔金属-有机框架材料选自3dom-pcn-601、3dom-pcn-14、3dom-zif-8、3dom-zif-67、3dom-zif-68、3dom-zif-69、3dom-zif-70、3dom-zif-78、3dom-zif-81、3dom-zif-82、3dom-zif-95、3dom-zif-100、3dom-uio-66中的一种或两种以上的混合物。
3.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述离子液体选自选自1,2-二甲基-3-乙氧基乙基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-甲基-3-乙氧基乙基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、n-丁基-n-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐、1-甲基-3-乙氧基甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、n-乙氧基甲基-n-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐、1-甲基-3-丁基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、n-乙氧基乙基-n-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐、n,n-二乙基-2-甲氧基乙基-n-甲基胺双三氟甲磺酰亚胺盐中的任一种。
4.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：张善岳，张善泰，
申请(专利权)人：山东三链医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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