【技术实现步骤摘要】
本申请涉及微生物多样性检测领域，尤其涉及一种基于拉曼光谱结合单细胞基因组测序技术的种水平的微生物多样性检测方法和系统。
技术介绍
1、人们越来越认识到环境微生物对地球生态的塑造作用，特别是人类微生物群可以影响我们健康、疾病的发生以及甚至影响我们的疾病治疗效果等，但对这些微生物群的全面描述仍然很困难。16s rrna基因扩增子测序提供一种识别宏基因组样本中不可培养微生物的多样性的方法，但该技术的系统发育分辨率有限(仅能鉴定到属水平)，另外该单基因之外的微生物基因组功能结构未被检测或只能间接推断。宏基因组测序提供了对组成生物体的所有基因组特征的检测，包括细菌、古菌、真菌等的染色体、质粒、转座子等。然而，多种技术挑战阻碍了通过短读下一代测序(ngs)方法收集的宏基因组测序数据的解释。ngs数据通常由数百万个<200bp的reads组成，提供了相当大的测序深度，但对存在于多个基因组中的复杂重复序列和类似序列的解析能力有限。这为重新组装宏基因组和解释由此产生的数千个小组装序列(称为contigs)提出了重大挑战。通过宏基因组分类(contig binning)的方法可以对这些contigs进行聚类，生成metagenome-assembled genomes(mag)。contigbinning方法不仅依赖于成功的从头组装，而且当样本包含多个高相似度的细菌基因组时，往往无法正确区分。差分覆盖(或覆盖协方差)方法，根据多个样本间相似的丰度剖面对contig进行binning，然而无法理清在样本间拥有相似丰度的生物体的基因组，也无法有效
2、单细胞测序技术是指在单细胞水平上,通过全基因组或转录组扩增,对核酸分子进行高通量测序的技术。该技术能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达水平,反映细胞间的异质性,剖析单个细胞对生态系统或有机体的贡献。相比扩增子测序和宏基因组测序,单细胞扩增和测序技术有其独特的不可替代的优点。如果说宏基因组数据集是捕获整个群落信息的一张巨网,那么单细胞测序方法则是分离目标基因组的“手术刀”和深入探究目标群落的“放大镜”,能不断细化、深化我们对微生物群落的认识。对目标细胞进行单细胞测序，首先需要找到目标细胞的特征；然后设计识别该特征的检测方法，如免疫荧光法、探针杂交法(fish)等。但是微生物多样性研究的样本中所有微生物的整体情况，包括已知和未知的微生物，我们没办法事先对未知微生物的特征进行了解并对其进行单细胞分选和测序研究。
3、拉曼光谱(raman spectroscopy,rs)法是一种利用非弹性散射光来提供特定样品生化信息的光学技术。该技术对核酸、脂类、蛋白质和碳水化合物等生物化学特征非常敏感，并且能够在不需要添加造影剂的情况下提供生物化学概况。rs法多年来一直被用于探测各种生物分子的生物化学，最近被应用于体外细菌的特征和识别。例如利用rs法来表征微生物菌落中的细菌特征，然后在较短的培养时间内检测它们的存在。另一个研究小组使用台式共聚焦拉曼显微镜来识别混合细菌生物膜模型中的细菌。此外，拉曼微光谱已用于肺炎支原体菌株分型，以区分多个菌株群。采用基于光纤探针的拉曼系统来表征细菌菌落光谱特征的可行性也已被证明，并用于确定对区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌重要的生化特征。虽然这些研究显示了rs在细菌检测和鉴定方面的潜力，但迄今为止没有人将其运用于微生物多样性的研究调查。
技术实现思路
1、本申请的目的之一在于针对现有技术中的问题中的一种或者多种，提出改进的微生物多样性检测方法。
2、为此，本申请的一些实施例公开了一种微生物多样性检测方法，该方法包括步骤：采集样本中单个细胞的拉曼光谱；对采集的拉曼光谱进行聚类鉴定区分类别并对各类别中的细胞数量进行数量统计；对每个鉴定区分的类别中细胞进行分选回收，对每个分选回收的类别中的细胞进行单细胞测序；对测序结果进行拼接；基于拼接结果进行物种鉴定；以及根据各类别的物种鉴定结果和经所述数量统计得到的各类别的细胞数量的统计结果进行微生物多样性检测。
3、在一些实施例中，还包括基于拼接结果对基因功能进行注释。
4、在一些实施例中，以及根据各类别的物种鉴定结果和经所述数量统计得到的各类别的细胞数量的统计结果生成物种丰度表进行微生物多样性检测。
5、本申请的另一些实施例公开了改进的微生物多样性检测方法，该方法包括步骤：采集样本中单个细胞的拉曼光谱；对采集的拉曼光谱进行聚类鉴定区分类别并对各类别中的细胞数量进行数量统计；对鉴定的特征类的单细胞进行混合回收；对所述混合回收的单细胞进行测序；并对测序结果进行拼接；对所述拼接结果进行混池拆分；基于混池拆分结果进行物种鉴定；根据各类别的物种鉴定结果和经所述数量统计得到的各类别的细胞数量生成物种丰度表。
6、在一些实施例中，基于混合策略对鉴定的特征类的单细胞进行混合回收，所述混合策略通过混池的数量、单个混池的类别(r-otu)数等参数等确定。
7、在一些实施例中，根据r-otu的形态、r-otu的丰度对r-otu的混合策略进行调整。
8、在一些实施例中，所述对混合策略的调整包括：令每个混池尽量混合不同形状、拉曼光谱差异度大的和不同丰度来源的r-otu；令同池r-otu设置细胞数量梯度；同时保证同一r-otu跨池存在，即在两个以上混池中出现，用来进一步定位r-otu与基因组拼接的对应关系；中的至少一种。
9、在一些实施例中，混池拆分步骤包括首先利用contig的kmer频率、gc含量、和/或同池r-otu细胞数量梯度等信息，采用变分自动编码器(vae)对contig进行聚类和拆分；然后根据聚类结果进行contig拆分，将contig序列拆分到不同类别组中；最后利用跨池存在的同一r-otu的信息，对拆分结果进行进一步的校正，最终获得每个r-otu的基因组序列。
10、在一些实施例中，还包括基于拼接结果对基因功能进行注释。
11、在一些实施例中，以及根据各类别的物种鉴定结果和经所述数量统计得到的各类别的细胞数量的统计结果生成物种丰度表进行微生物多样性检测。
12、本申请还公开了微生物多样性检测系统，其包括拉曼光谱采集器以完成拉曼光谱的采集；单细胞分选/采集仪以完成单细胞获取；单细胞扩增-建库-测序系统用于完成单细胞测序；以及计算机分析系统，所述计算机分析系统被配置为存储有计算机程序，执行所述计算机程序可实施上述权利要求中任意一项所述的微生物多样性检测方法。
13、本申请中的方法和系统通过拉曼光谱法非监督的对环境样本中的单细胞进行了r-otu聚类和单细胞分选，克服了传统单细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微生物多样性检测方法，其特征在于：该方法包括步骤：采集样本中单个细胞的拉曼光谱；对采集的拉曼光谱进行聚类鉴定区分类别并对各类别(R-OTU)中的细胞数量进行数量统计；对每个鉴定区分的类别中细胞进行分选回收，对每个分选回收的类别中的细胞进行单细胞测序；对测序结果进行拼接；基于拼接结果进行物种鉴定；以及根据各类别的物种鉴定结果和经所述数量统计得到的各类别的细胞数量的统计结果进行微生物多样性检测。
2.一种微生物多样性检测方法，其特征在于：该方法包括步骤：采集样本中单个细胞的拉曼光谱；对采集的拉曼光谱进行聚类鉴定区分类别并对各类别中的细胞数量进行数量统计；对鉴定的特征类的单细胞进行混合回收；对所述混合回收的单细胞进行测序；并对测序结果进行拼接；对所述拼接结果进行混池拆分；基于混池拆分结果进行物种鉴定；根据各类别的物种鉴定结果和经所述数量统计得到的各类别的细胞数量生成物种丰度表。
3.根据权利要求2的微生物多样性检测方法，其特征在于：基于混合策略对鉴定的特征类的单细胞进行混合回收，所述混合策略通过混池的数量、单个混池的类别(R-OTU)数确定。
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