【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种全血中cd20单克隆抗体受体占位的检测方法。
技术介绍
1、受体占位(receptor occupancy，ro)是评价药物与受体结合的重要研究内容。受体占位率(ro％)是评价药物靶点作用水平最直接的药效学指标。ro常用于细胞靶向单抗类药物与细胞靶点的结合量评估，在药物开发的各个阶段均发挥作用，在临床应用中作为一种替代标志物，辅助药效的评估意义重大。ro通常有2种测定模式：给药后游离受体的测定和药物结合受体的测定。ro％可直观反映某一时刻药物对靶点作用的程度，可辅助药理学效应用于临床效果的评估参考；同时广泛应用于药物pkpd(pharmacokinetics，pk；pharmacodynamic，pd)关系模型的构建、首次人类研究(first in human，fih)中起始剂量的选择、最小生物效应水平(minimum anticipated biological effect level，mabel)与给药周期的确定中。目前仍存在多个影响ro测定的技术性缺陷，包括无法直接量化占据的受体数量、缺乏稳定全血的有效方法和低效的数据分析。由此可见更广泛地使用ro方法前还有很长的路要走。
2、cd20是指存在于b淋巴细胞表面的一种分子标记物，其它类型的淋巴细胞中都没有cd20分子标记物。由于这种分子标记物只存在于b淋巴细胞当中，所以在临床上专利技术了cd20的单克隆抗体。cd20单克隆抗体是一种常用于治疗b淋巴瘤的单克隆抗体制剂,在b细胞淋巴瘤细胞表面含有大量的cd20，cd20单抗可以结合在
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中暂无报道的cd20单抗的受体占位分析技术，优化方法流程提高稳定全血的有效方法。
2、专利技术人基于流式细胞技术平台，通过调整孵育时间和裂红时间等条件，优化试验流程，样品进样后通过fsc和ssc特征圈出淋巴细胞的位置。pe mouse anti-human cd20可特异性与淋巴细胞表面的cd20结合，圈出pe+细胞，即为cd20+细胞，从而检测cd20+细胞占淋巴细胞的百分率。
3、本专利技术通过以下技术方案解决上述问题。
4、本专利技术的第一方面提供一种全血样本中cd20受体占位的检测方法，所述方法包括以下步骤：
5、(1)将全血样本与稀释得到的不同浓度药物溶液以1:1-10:1的体积比混匀后室温孵育；
6、(2)加入过量荧光cd20抗体，混匀后，2-8℃避光孵育；
7、(3)裂解溶液中的红细胞；
8、(4)取步骤(3)裂解后的溶液，流式细胞仪检测，流式细胞仪参数设置为可区分出阳性细胞群体；
9、(5)根据如下公式计算cd20受体占位：cd20受体占位＝所述荧光cd20抗体阳性率-测得不同药物浓度血中荧光cd20抗体阳性率。
10、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法包括以下条件的一种或多种：
11、步骤(1)中所述全血样本选自灵长类动物全血样本；所述药物为与cd20特异性结合的药物；所述室温孵育时间为20min-180min；
12、步骤(2)中所述荧光cd20抗体为荧光素偶联的与cd20特异性结合的单克隆抗体；
13、步骤(3)中所述裂解使用红细胞裂解液；
14、步骤(4)中所述流式细胞仪荧光通道选用pe、fitc、pe-tr、pi、pe-cy5、percp、apc或apc-cy7。
15、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述全血样本选自智人、食蟹猴、恒河猴、猕猴、狨猴或金丝猴的全血样本。
16、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述荧光cd20抗体为pe mouse anti-humancd20。
17、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法步骤(4)中流式细胞仪荧光通道选用pe；增益设置为：fsc为250-300，ssc为450-500，pe为450-500。
18、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法步骤(4)中增益设置为：fsc为275.5，ssc为480.6，pe为473.6。
19、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述药物为human cd20 antibody。
20、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法步骤(1)中所述室温孵育时间为120min。
21、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法包括以下条件的一种或多种：
22、步骤(1)中所述全血样本体积为50μl-100μl；所述药物体积为10μl-30μl；所述室温为0℃-30℃；
23、步骤(2)中所述荧光cd20抗体体积为1μl-5μl；所述避光孵育时间为20min-40min；
24、步骤(3)中所述红细胞裂解液体积为500μl-1000μl；
25、步骤(4)中所述溶液体积为100μl-300μl；所述流式细胞仪参数设置为：流速选择中速，为50μl/min-70μl/min。
26、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法包括以下条件的一种或多种：
27、步骤(1)中所述全血样本为食蟹猴全血样本；所述全血样本体积为80μl；所述药物体积为20μl；所述室温为25℃；所述孵育时间为120min；
28、步骤(2)中所述荧光cd20抗体体积为1μl；所述避光孵育时间为30min；
29、步骤(3)中所述红细胞裂解液体积为800μl；
30、步骤(4)中所述溶液体积为200μl；所述流式细胞仪参数设置为：流速为60μl/min。
31、本专利技术通过优化试验条件，建立了cd20单克隆抗体受体占位分析方法，提高了全血稳定性，为类似药物的受体占位方法建立提供了参考。
32、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
33、本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
34、本专利技术的积极进步效果在于：提供一种全新的cd20抗体受体占位的检测方法；本专利技术提供的检测方法性能优良，同时可以实现受体占位检测中较好的全血48h内的稳定性。
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1.一种全血样本中CD20受体占位的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下条件的一种或多种：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述全血样本选自智人、食蟹猴、恒河猴、猕猴、狨猴或金丝猴的全血样本。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光CD20抗体为PE Mouse Anti-HumanCD20。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(4)中流式细胞仪荧光通道选用PE；增益设置为：FSC为250-300，SSC为450-500，PE为450-500。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(4)中增益设置为：FSC为275.5，SSC为480.6，PE为473.6。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述药物为Human CD20antibody。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(1)中所述室温孵育时间为120min。
9.如权利要求1-8任一项所述
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下条件的一种或多种：
...【技术特征摘要】
1.一种全血样本中cd20受体占位的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下条件的一种或多种：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述全血样本选自智人、食蟹猴、恒河猴、猕猴、狨猴或金丝猴的全血样本。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光cd20抗体为pe mouse anti-humancd20。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(4)中流式细胞仪荧光通道选用pe；增益设置为：fsc为250-300，ssc为450-5...
【专利技术属性】
技术研发人员：缪峰，陶庭磊，李华，马琳，陈文彬，张华婷，李佳欣，
申请(专利权)人：益诺思生物技术南通有限公司，
类型：发明
国别省市：
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