【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯的合成基因及其应用，尤其涉及一种调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯的合成基因pagbr6ox及其应用，属于生物基因工程。
技术介绍
1、木材是生产、生活中必须的可再生资源。木材资源不足限制了我国造纸业的发展。工业上通过塑化溶解木纤维细胞中的木质素，重新交织纤维素和半纤维素，从而得到优质纸张。木材纤维原料的改良对于造纸业有重大生物意义。纤维越长，长宽比越大，纤维比例越高，柔性和弹性好，且具有低木质素高纤维素的纤维原料，越有利于作为生产原料。
2、杨树是一种在全球广泛分布的经济树种，具有早期速生、适应性强、分布广、品种多、易杂交、易改良遗传性、易繁殖等特点，因而广泛用于集约栽培。杨树的用途很广，不仅用于加工业用材，而且是胶合板、纤维板、造纸、卫生筷和包装业的重要原材料。不仅有巨大的经济效益，而且有很大的生态效益和社会效益。因此，急需发展木材产量增加，木质素含量降低的优质高产杨树新品种。利用分子生物学和基因工程技术，提高杨树木材产量和改良杨树木材品质具有重要理论意义和应用价值。
3、木材产量与木纤维细胞的品质是由维管形成层的分裂活性和木质部分化活性共同决定的。前期研究表明，杨树维管形成层的分裂活性和木质部分化活性受到激素等信号的调控。油菜素内酯(brassinosteroids)是植物中存在的一类植物甾醇类激素。油菜素内酯在植物生长和发育中起着重要作用，调节多种细胞发育过程，例如细胞伸长、细胞分裂、木质部分化以及非生物和生物胁迫响应。前期研究表明，油菜
4、研究表明，油菜素内酯的合成受到多个基因的调控，其中，br6ox基因编码一个c6氧化酶，可以催化油菜素甾酮转变为油菜素内酯，是油菜素内酯合成途径中的一个晚期限速酶。因此，研究br6ox基因在植物发育中的作用，可以进一步揭示油菜素内酯调控木材形成与木纤维细胞延展的分子机制，有利于创制优质木纤维品质的杨树新品种。
5、因此，提供一种调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯的合成基因pagbr6ox及其应用，基于分子生物学和基因工程技术，以木本植物作为研究对象，为解析油菜素内酯调控杨树木材发育的分子机制提供新的思路，对于林木育种改良具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的之一是提供一种调控杨树木材产量和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因br6ox。
2、为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：
3、一种调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
4、本专利技术的另一目的是提供上述调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的表达蛋白。
5、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：
6、一种调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的表达蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
7、本专利技术的再一目的是提供上述调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基的植物表达载体。
8、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：
9、一种含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
10、本专利技术的再一目的是提供一种含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法。
11、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：
12、一种含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法，其步骤如下：
13、(1)：克隆pagbr6ox基因
14、以84k(p.alba x p.glandulosa)银腺杨为材料，使用rneasy plant mini试剂盒和rnase-free dnase i试剂盒(qiagen，hilden，germany)提取组培苗84k的总rna；每个样品取2.0μg rna，通过使用superscript iii first-strand synthesis system(lifetechnologies，carlsbad，ca，usa)合成cdna第一链；参考已发表毛果杨基因组序列，使用primer3软件设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行基因全长扩增；
15、(2)：pagbr6ox基因植物表达载体构建
16、利用克隆技术构建pagbr6ox基因的过量表达载体，使用primer3软件设计载体特异pcr引物，以之前从84k cdna扩增得到的pagbr6ox为模板，进行pcr扩增；
17、将pagbr6ox基因的cds构建到目标载体，目标载体为pcambia1300(seq入门载体pcambia1300：10177bp)；
18、(3)目标载体需要先用apai酶进行酶切；
19、(4)通过同源重组反应将两端带有载体特异性引物的目标基因构建至植物表达载体pcambia1300，构建完成的最终载体的序列如序列表中序列3所示；
20、(5)最终构建完成的载体为pcambia-pagbr6ox。
21、优选地，步骤(1)中，pagbr6ox cds正向引物如序列表中序列4所示，pagbr6ox cds反向引物如序列表中序列5所示；高保真pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶primestar7.5μl，pagbr6ox cds正向引物(10μm)0.15μl，pagbr6ox cds反向引物(10μm)0.15μl，模板(84k杨cdna)0.8μl，无菌ddh2o补足至15μl，反应程序：98℃，1min；(98℃，10s；56℃，15s；72℃，2min：35个循环)；72℃，3min。
22、优选地，步骤(2)中，pagbr6ox载体特异正向引物如序列表中序列6所示，pagbr6ox载体特异反向引物如序列表中序列7所示。
23、优选地，步骤(3)中，酶切体系如下：目标载体pcambia1300 5ng(根据浓度换算体积)；apai酶3μl；10x green buffer 3μl；ddh2o，补足至30μl，反应体系：37℃，30min。
24、优选地，步骤(4)中，同源重组反应体系：经过apai酶切过的pcambia1300 80ng(目标载体默认用量为80ng，根据浓度换算体积)；同源重组酶用量3.75μl；ddh2o，补足至10μl，反应体系：45℃，30min；步骤(5)中，在pagbr6ox基因的5’端具有组成型强表达启动子p35s，它能使pagbr6ox基因在杨树体内高效表达；在pagbr6ox基因的3’端组装有强终止子nos，可有效终止pagbr6ox基因的转录。...
【技术保护点】
1.一种调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2.权利要求1所述调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的表达蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.一种含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
4.权利要求3所述含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法，其步骤如下：
5.权利要求4所述含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，PagBR6OX CDS正向引物如序列表中序列4所示，PagBR6OX CDS反向引物如序列表中序列5所示；高保真PCR反应体系如下：TaKaRa高保真扩增酶PrimeSTAR 7.5μl，10μM的PagBR6OX CDS正向引物0.15μl，10μM的PagBR6OXCDS反向引物0.15μl，模板84K杨cDNA0.8μl，无菌ddH2O补足
6.权利要求5所述含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，PagBR6OX载体特异正向引物如序列表中序列6所示，PagBR6OX载体特异反向引物如序列表中序列7所示。
7.权利要求6所述含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，酶切体系如下：目标载体pCAMBIA13005ng；ApaI酶3μl；10x green buffer 3μl；ddH2O，补足至30μl，反应体系：37℃，30min。
8.权利要求7所述含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(4)中，同源重组反应体系：经过ApaI酶切过的pCAMBIA1300 80ng；同源重组酶用量3.75μl；ddH2O，补足至10μl，反应体系：45℃，30min；步骤(5)中，在PagBR6OX基因的5’端具有组成型强表达启动子P35S，它能使PagBR6OX基因在杨树体内高效表达；在PagBR6OX基因的3’端组装有强终止子NOS，可有效终止PagBR6OX基因的转录。
9.权利要求2所述调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的遗传转化，其步骤如下：通过冷激法，将所构建的pC1300-PagBR6OX过量表达载体转入农杆菌EHA105中，通过农杆菌介导的叶盘转化法，将PagBR6OX基因转入84K杨树。
10.权利要求1所述调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因在调控杨树生长发育过程中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2.权利要求1所述调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的表达蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.一种含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
4.权利要求3所述含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法，其步骤如下：
5.权利要求4所述含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，pagbr6ox cds正向引物如序列表中序列4所示，pagbr6ox cds反向引物如序列表中序列5所示；高保真pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶primestar 7.5μl，10μm的pagbr6ox cds正向引物0.15μl，10μm的pagbr6oxcds反向引物0.15μl，模板84k杨cdna0.8μl，无菌ddh2o补足至15μl，反应程序：98℃，1min；98℃，10s；56℃，15s；72℃，2min，35个循环；72℃，3min。
6.权利要求5所述含有调控杨树木材生成和木纤维长度的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，pagbr6ox载体特异正向...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜娟，叶天琪，徐明玲，周冲，寿惠霞，卢孟柱，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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