【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质工程和生物催化领域。更具体地，本专利技术涉及新的多肽，除其他之外，这些多肽能够使环状和非环状脂肪族烯烃、萜烯、乙烯基芳烃以及相关化合物氧化。本专利技术还涉及与其相关的方法和用途。
技术介绍
1、萜烯是主要由植物、特别是针叶树产生的一类不饱和烃。萜烯进一步以碳数分类：单萜烯(c10)、倍半萜烯(c15)、二萜烯(c20)等。(https://en.wikipedia.org/wiki/terpene)。由于它们的高挥发性和令人愉悦的嗅觉特性，因而萜烯对于调味品和香料工业、以及对于食品&饲料、以及当改性时对于药物和精细化学品工业是高度受关注的。萜烯的氧官能化、特别是以立体-、区域-和对映体选择性方式的羟基化和环氧化是经常需要的反应。一些单萜，像α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、柠檬烯(苧烯，limonene)、莰烯、萜品油烯(异松油烯，terpinolene)已经被认为是可用于工业应用的可再生原料。
2、这项工作建立在植物种子过氧化酶的已知特性上，植物种子过氧化酶已经被描述为属于油体钙蛋白样(钙结合)蛋白(j.biol.chem.vol.281,no.44,pp.33140-33151,2006年11月3日)。这些是包含血红素的蛋白质，其包含ef-手钙结合基序。这些蛋白质发现于燕麦微粒体(microsomes)和脂滴(lipid droplets)中，它们是膜结合的并且它们催化不饱和脂肪酸的氢过氧化物依赖性单加氧，从而作为产物产生脂肪酸氢过氧化物。在植物中，它们与环氧化物水解酶一起形成所谓的“过氧
3、fuchs等人(j.mol.catalysis b:enzymatic 96(2013)52-60)公开了番茄(solanum lycopersicum)油体钙蛋白样过氧化酶用于萜烯的氧官能化的用途。
4、各种报道可见于描述植物油体钙蛋白和真菌同源物的重组生产的文献中。然而，在商业规模上应用这些酶受到多种障碍的阻碍。现有的油体钙蛋白样/过氧化酶的改善和(工业)应用的主要缺点是它们是真菌或植物来源的事实。这需要植物或真菌表达系统，这阻碍了生产和工程化的努力。
5、因此，本专利技术人提出克服至少部分的这些缺点。更具体地，提出鉴定(识别，确认，identify)非真菌和非植物来源的并具有高底物混杂性(即，对多组(商业相关的)底物示出油体钙蛋白样过氧化酶活性)的新酶。理想地，该酶可以在快速生长且易于操作的宿主细胞(例如，酵母宿主细胞)中以高水平表达，或更优选地在甚至更快速生长且更易于操作的宿主细胞(例如，细菌宿主细胞)中表达。
技术实现思路
1、出人意料地发现，使用拟南芥油体钙蛋白(aee85247.1)的序列，可以鉴定出多种对各种萜烯和其他不饱和分子显示出所需催化活性(即，环氧化和羟基化)的细菌同源物。这些酶可以以良好的产率在细菌中表达和从细菌中纯化。开发了使用洗涤剂(除垢剂，detergent)的容易程序，用于从宿主细胞中分离重组产生的酶。此外，使用分泌信号，重组蛋白的产量可以增加并且其定位可以靶向膜和周质(外周胞质，periplasm)。有利地，这些酶可以以分离的形式和以全细胞的形式使用。
2、这种转化的主要产物是可以自发地或使用催化剂(化学的或酶促的)进一步水解的环氧化物。我们设想在此描述的酶和方法可以用于f&f、化妆品和食品&饮料。除了那些应用之外，存在使用改性的萜烯和不饱和结构单元作为药物和聚合物工业中的结构单元的潜力。
3、因此，本专利技术涉及具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的分离的多肽，其选自由以下各项组成的组：
4、(a)多肽，包括当与seq.no.2(参见图1；表1)的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少50％配对序列一致性的氨基酸序列，并且包括至少以下血红素配合基序(heme-coordinating motifs)：
5、i)hxxffd，
6、ii)h(x)xd，优选hxxd，更优选hxsd，最优选hgsd，其中x是任何氨基酸；
7、(b)(a)的多肽的片段，具有油体钙蛋白样过氧化酶活性。
8、在一个实施方式中，本专利技术提供了一种用于所关注的底物的氧官能化的方法，包括使环状或非环状脂肪族烯烃或萜烯底物与过氧化氢源和具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(ec 1.11.2.1)接触，其中该多肽选自由以下各项组成的组：
9、(a)多肽，包括当与图1中所示的序列的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少50％配对序列一致性的氨基酸序列，并且包括至少以下血红素配合基序：
10、i)hxxffd；
11、ii)h(x)xd，优选hxxd，更优选hxsd，最优选hgsd；其中x是任何氨基酸；以及
12、(b)(a)的多肽的片段，具有油体钙蛋白样过氧化酶活性。
13、在具体方面中，本专利技术提供了一种用于所关注的底物的氧官能化的方法，包括使底物与过氧化氢源和具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(ec 1.11.2.1)接触，其中该多肽是细菌来源的并且选自由以下各项组成的组：
14、(a)多肽，包括优选地当与图1的seq.no.2-10中描绘的细菌序列中的任一个的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少60％配对序列一致性的氨基酸序列，并且包括至少以下血红素配合基序：
15、i)hxxffd；
16、ii)h(x)xd，优选hxxd，更优选hxsd，其中x是任何氨基酸；以及
17、(b)(a)的多肽的片段，具有油体钙蛋白样过氧化酶活性。
18、现有技术并未教导或建议在本文中鉴定的细菌多肽，更不用说它们有利地用于所关注的底物的氧官能化。
19、在此使用的术语“具有油体钙蛋白样过氧化酶活性”是指催化不饱和脂肪酸环氧化的能力。示例性的活性包括环氧化，例如油酸的环氧化。
20、使用本领域已知的测定法，可以容易地筛选具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(片段)。例如，不饱和脂肪酸如油酸的环氧化。此外，可以使用本领域已知的测定法鉴定显示过氧化物酶活性的多肽。例如，可以检测abts(2,2’-次偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))、愈创木酚和/或2,6-二甲氧基苯酚的氧化(van bloois et al.appl microbiolbiotechnol.2010；86(5):1419-1430)。优选地，当使用5μm酶时，根据本专利技术的具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽显示出在25℃下在4h内转化至少15％的1mm油酸的体外活性。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于氧官能化所关注的底物的方法，包括使所述底物与过氧化氢源和具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(EC 1.11.2.1)接触，其中所述多肽是细菌来源的并且选自由以下各项组成的组：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽包含钙结合EF-手基序。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述钙结合EF-手基序包含对应于表2中所示的Seq.No.2的氨基酸序列的E42、E129和E150的两个或更多个谷氨酸残基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与图1的Seq.No.2-10中的任一个具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％配对序列一致性的序列，或其具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的片段。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多肽包含Seq.No.
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽进一步包含能够增强表达、溶解、纯化、靶向、分泌和/或固定的N-和/或C-末端蛋白标签。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含在全细胞或无细胞提取物中
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述底物是脂肪族烯烃、乙烯基芳烃或萜烯。
9.根据权利要求8所述的方法，其中脂肪族烯烃底物具有选自由卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、巯基、磺酰基、甲酰基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、氨基甲酰基和氨磺酰基组成的组中的一种或多种取代基。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述取代基选自由氯、羟基、羧基和磺酰基组成的组，特别是氯和羧基。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述脂肪族烯烃包含至少三个碳原子，并且在一端具有碳-碳双键。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中脂肪族烯烃底物是非环状脂肪族烯烃，优选地选自由丙烯、丁烯、戊烯、己烯、庚烯、辛烯、壬烯、癸烯、十一烯、十二烯、十三烯、十四烯、十五烯或十六烯以及它们的异构体组成的组。
13.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中，脂肪族烯烃底物是环状脂肪族烯烃，优选地选自由环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯和环辛烯组成的组。
14.根据权利要求8所述的方法，其中乙烯基芳烃底物是苯乙烯、β-甲基苯乙烯、茚或茋。
15.根据权利要求8所述的方法，其中萜烯底物是异戊二烯或单萜烯，优选地其中所述萜烯是环萜烯，更优选单环单萜烯，如柠檬烯。
16.一种用于制备取代的或未取代的靛蓝染料的方法，包括使取代的或未取代的吲哚与过氧化氢源和权利要求1-7中任一项所限定的多肽接触，优选地其中所述多肽包含Seq.No.2或3的序列，或其具有过氧化酶活性的片段。
17.权利要求1-7中任一项所限定的多肽作为生物催化剂的用途，优选地作为用于氧官能化，优选地环氧化脂肪族烯烃、乙烯基芳烃或萜烯底物的催化剂的用途。
18.一种核酸构建体或表达载体，包含编码权利要求1-7中任一项所限定的多肽的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可操作地连接至指导所述多肽在细菌或真菌表达宿主中生产的一个或多个控制序列。
19.一种重组宿主细胞，优选细菌或真菌宿主细胞，包含权利要求18所述的核酸构建体或表达载体。
20.一种生产具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽的方法，包括：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于氧官能化所关注的底物的方法，包括使所述底物与过氧化氢源和具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(ec 1.11.2.1)接触，其中所述多肽是细菌来源的并且选自由以下各项组成的组：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽包含钙结合ef-手基序。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述钙结合ef-手基序包含对应于表2中所示的seq.no.2的氨基酸序列的e42、e129和e150的两个或更多个谷氨酸残基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与图1的seq.no.2-10中的任一个具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％配对序列一致性的序列，或其具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的片段。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多肽包含seq.no.
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽进一步包含能够增强表达、溶解、纯化、靶向、分泌和/或固定的n-和/或c-末端蛋白标签。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含在全细胞或无细胞提取物中，或其中所述多肽作为纯化的酶和可选地固定的酶使用。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述底物是脂肪族烯烃、乙烯基芳烃或萜烯。
9.根据权利要求8所述的方法，其中脂肪族烯烃底物具有选自由卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、巯基、磺酰基、甲酰基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、氨基甲酰基和氨磺酰基组成的组中的一种或多种取代基。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述取代基选自由氯、羟基、羧基和磺酰基组成的组，特别是氯和羧基。
11.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：尼古拉·龙卡，许霍·范贝克，马可·威尔海尔默斯·弗拉耶，
申请(专利权)人：贺高生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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