【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及烟酰胺单核苷酸等核酸系化合物的制造方法。
技术介绍
1、烟酰胺单核苷酸(nmn)为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的合成中间体。近年来，明确了nmn通过向nad+的转变来控制长寿基因“sirtuin”的活性，如果将nmn施与至小鼠则显示抗衰老作用。进一步，还报道了nmn对于糖尿病、阿尔茨海默症、心力衰竭等疾病的预防、症状的改善有效果。期待这样的nmn作为功能性食品、药品、化妆品等的成分的用途，以生产性的提高为目标，高效的制造方法的研究开发正在进行着。
2、专利文献1中记载了nmn的制造方法(权利要求1、13、15等)，其为将使烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)过表达了的细胞(酵母、细菌等)分离，在烟酰胺(nam)的存在下培养该细胞。nampt是由nam和细胞内被生物合成的磷酸核糖焦磷酸(prpp)来生成nmn的酶。专利文献1中还记载了为了促进prpp的生物合成，对于上述细胞使磷酸核糖焦磷酸合成酶(prs)进一步过表达(权利要求3等)。prs为由核糖-5-磷酸(r5p)和atp来生成prpp和amp的酶。专利文献1中，在有效利用过表达特定酶的细胞的状态下，一边用含有碳源、氮源等的培养基进行培养，一边通过生物体内的酶反应来生成nmn等目标化合物。
3、专利文献2中记载了使用了相对于反应生成物的感受性被减弱(即，由于难以经受利用prs生成的prpp带来的负反馈，因此能够增加prpp向体系内的供给量)的prs突变体的nad前体合成系统(权利要求1，第0068段等)。还记载了该prs突变体可以是在重组
4、另一方面，非专利文献1中记载了使用核糖激酶(rbk，该文献中被表述为rk)、prs(同样地被表述为pps)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(8b3)这三种酶，由核糖合成肌苷一磷酸(imp)的方法。rbk参与由核糖和atp生成r5p和adp的反应(i)，prs参与由r5p和atp生成prpp和amp的反应(ii)，8b3参与(iii)由prpp和肌苷酸生成imp和焦磷酸(ppi)的反应。上述非专利文献1记载的方法中，利用腺苷酸激酶由反应(ii)所生成的amp来再生adp。此外，由该被再生的adp和反应(i)所生成的adp，利用磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶来再生atp。
5、专利文献3中记载了atp的制造方法，其为使作为单独能够由amp来合成atp的酶的多磷酸激酶(ppk)2型与多磷酸及amp发生反应。作为这样的多磷酸激酶2型，公开了来源于嗜热菌(细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongatus)等)的具有特定氨基酸序列的多磷酸激酶。专利文献3中进一步还记载了在利用atp来制造物质(目标化合物)的方法中，通过同时实施上述atp的制造方法，从而使目标化合物的合成反应与atp的再生反应结合，由amp再生的atp被用于目标化合物的合成。
6、专利文献4中记载了将大肠杆菌在60～80℃进行加热，在大肠杆菌的细胞膜被破坏的状态下，进行atp的再生反应的方法，其中，大肠杆菌包含来源于即使在70℃、10分钟的热处理时也不失活的嗜热菌的ppk的基因，此外，在60～80℃时该大肠杆菌的通常的酶丧失活性并且获得多磷酸的细胞透过性。
7、专利文献5中记载了烟酰胺单核苷酸的制造方法，其为将nam、atp和核糖作为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和核糖激酶的催化剂作用下进行反应。
8、非专利文献2中记载了利用来源于嗜热菌的ppk和利用该ppk的atp再生体系的甘油三磷酸合成方法。在该方法中，使用包含甘油、adp、多磷酸、甘油激酶(gk)、ppk等的缓冲液作为起始反应液，一边逐次添加多磷酸，一边进行反应。
9、非专利文献3中记载了谷胱甘肽的制造方法，其为使来源于血链球菌(streptococcus sanguinis)的谷胱甘肽合成酶(gshf)和由具有与专利文献3所记载的物质同样活性的来源于嗜热菌即细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongates)bp-1的ppk得到的atp再生体系结合，利用级联反应进行。
10、现有技术文献
11、专利文献
12、专利文献1：国际公开2015/069860号
13、专利文献2：国际公开2016/198948号
14、专利文献3：日本特开2013-021967号
15、专利文献4：日本特开2007-143463号
16、专利文献5：国际公开2017/185549号
17、非专利文献
18、非专利文献1：scism,robert a.和bachmann,brian o.“five-component cascadesynthesis of nucleotide analogues in an engineeredself-immobilizedenzymeaggregate.”chembiochem 11.1(2010):67-70.
19、非专利文献2：restiawaty,elvi等人“feasibility ofthermophilic adenosinetriphosphate-regeneration system using thermusthermophilus polyphosphatekinase.”process biochemistry 46.9(2011):1747-1752.
20、非专利文献3：zhang,xing等人“one-pot synthesis ofglutathione by a two-enzyme cascade using a thermophilic atp regenerationsystem.”journal ofbiotechnology 241(2017):163-169.
技术实现思路
1、专利技术所要解决的课题
2、然而，专利文献1～5和非专利文献1～3所公开的方法在有效率地制造nmn方面存在问题，不能说是优异的方法。具体而言，专利文献1中，在有效利用过表达特定酶的细胞的状态下，一边利用含有碳源、氮源等的培养基进行培养，一边通过生物体内的酶反应来生成nmn，但其生成量为300nmol-nmn/g-酵母湿菌体重量(实施例1)。如果酵母干燥菌体重量/酵母湿菌体重量之比假定为0.2，则成为约0.5g-nmn/kg-酵母干燥菌体重量，存在生成量低这样的问题。
3、专利文献2中记载了使用了相对于反应生成物的感受性被减弱的prs突变体的nad前体合成系统。然而，没有记载显示nmn生成的实施例，没有显示具体的nmn的制造方法、生成量。
4、专利文献3中记载了将atp的制造方法与目标化合物的合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法，其包括下述工序：使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)及多磷酸激酶(Ppk)这三种酶的表达被强化而得的转化体、表达所述三种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖-5-磷酸(R5P)、烟酰胺(NAM)、ATP及多磷酸接触。
2.根据权利要求1所述的NMN的制造方法，其进一步包括下述工序：使核糖激酶(Rbk)及多磷酸激酶(Ppk)这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达所述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖、ATP及多磷酸接触来制造所述R5P。
3.根据权利要求1或2所述的NMN的制造方法，在转化体实质上不增殖的条件下进行。
4.根据权利要求1或2所述的NMN的制造方法，所述Nampt来源于细菌。
5.根据权利要求1或2所述的NMN的制造方法，所述Ppk为多磷酸激酶2型家族。
6.根据权利要求1或2所述的NMN的制造方法，所述转化体的宿主为大肠杆菌、棒状杆菌属细菌、红球菌属细菌或酵母。
7.一种转化体，其是
8.一种转化体，其是核糖激酶(Rbk)及多磷酸激酶(Ppk)这两种酶的表达被强化而得的转化体。
9.一种烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法，其包括下述工序：在焦磷酸酶(PPase)的存在下，使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达被强化而得的转化体、表达所述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与烟酰胺(NAM)及磷酸核糖焦磷酸(PRPP)接触。
10.根据权利要求9所述的NMN的制造方法，在转化体实质上不增殖的条件下进行。
11.根据权利要求9或10所述的NMN的制造方法，所述处理物为精制酶。
12.一种NMN的制造方法，其包括下述工序：
13.根据权利要求1、9和12中任一项所述的NMN的制造方法，反应体系中添加的ATP、ADP和AMP各摩尔数的总和为生成的NMN的摩尔数的0.5当量以下。
14.一种NMN的制造方法，其是烟酰胺单核苷酸(NMN)的制造方法，包括下述工序：使烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)及磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达所述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖-5-磷酸(R5P)、烟酰胺(NAM)及ATP接触，
15.根据权利要求14所述的NMN的制造方法，其进一步包括下述工序：使核糖激酶(Rbk)的表达被强化而得的转化体、表达所述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液或它们的处理物与核糖及ATP接触来制造所述R5P。
...【技术特征摘要】
1.一种烟酰胺单核苷酸(nmn)的制造方法，其包括下述工序：使烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(prs)及多磷酸激酶(ppk)这三种酶的表达被强化而得的转化体、表达所述三种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖-5-磷酸(r5p)、烟酰胺(nam)、atp及多磷酸接触。
2.根据权利要求1所述的nmn的制造方法，其进一步包括下述工序：使核糖激酶(rbk)及多磷酸激酶(ppk)这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达所述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖、atp及多磷酸接触来制造所述r5p。
3.根据权利要求1或2所述的nmn的制造方法，在转化体实质上不增殖的条件下进行。
4.根据权利要求1或2所述的nmn的制造方法，所述nampt来源于细菌。
5.根据权利要求1或2所述的nmn的制造方法，所述ppk为多磷酸激酶2型家族。
6.根据权利要求1或2所述的nmn的制造方法，所述转化体的宿主为大肠杆菌、棒状杆菌属细菌、红球菌属细菌或酵母。
7.一种转化体，其是烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(prs)及多磷酸激酶(ppk)这三种酶的表达被强化而得的转化体。
8.一种转化体，其是核糖激酶(rbk)及多磷酸激酶(ppk)这两种酶的表达被强化而得的...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。