【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种代谢工程改造大肠杆菌产乙醇酸的方法，属于生物工程。
技术介绍
1、乙醇酸(hoch2cooh)又3名羟基乙酸或甘醇酸，是一种无色、无味的半透明固体，分子量为76.05，是分子量最小果酸，其结构中同时含有活泼的羟基和羧基，具有良好的反应活性、较强的穿透性和水溶性，可以广泛应用于化学清洗、日用化工，同时，乙醇酸可以促进皮肤新陈代谢，在较短的疗程内可以缓解斑点、暗疮、皱纹等皮肤问题。在包装及材料行业，乙醇酸聚合生产的聚乙醇酸(pga)和聚乙醇酸-乳酸共聚物(plga)等具有良好的生物可降解性，可以用作食品和饮料的新型包装材料。
2、随着代谢工程和合成生物学的快速发展，使用污染小、成本低、可持续的生物法生产乙醇酸受到研究者的广泛关注，大肠杆菌因其遗传背景清晰、易于改造和易于培养等诸多优点被选作最有潜力的乙醇酸生产菌株，之前大肠杆菌生产乙醇酸的研究大多采用静态调控策略，静态调控策略因无法感知细胞生长过程中的代谢变化从而不可避免的给菌株造成代谢负担过重、生长迟缓、中间产物积累等问题，这会限制目标产物的产量和产率无法进一步提高，而使用动态调控策略可以平衡细胞生长和产物合成，减轻代谢负担，进一步提高目标产物的产量。因此，本专利技术将乙醇酸传感器应用于乙醇酸的生产，使菌株能自发生产乙醇酸，且生产的乙醇酸能激活乙醇酸传感器，从而不断动态放大乙醇酸的合成。此外，还原性辅因子nadph的缺失也限制着乙醇酸的生产，增加nadph的供给可以进一步乙醇酸产量，因此，本专利技术结合动态调控策略与nadph供给策略共同提高乙醇酸产量
技术实现思路
1、本专利技术根据结合能修改了乙醇酸传感器的-10区和-35区，并将修改的传感器应用于乙醇酸的生产中，实现了自发生产乙醇酸，生产的乙醇酸又能激活乙醇酸传感器，从而增加乙醇酸合成路径关键基因的表达，将更多的代谢流引入乙醇酸合成路径中，实现了动态放大法生产乙醇酸。所述动态放大生产乙醇酸方法的原理位于图1中的a。
2、在本专利技术的一种实施方式中，所述的结合能与-10区和-35区序列的对应表位于图1中的b。
3、在本专利技术的一种实施方式中，所述修改的乙醇酸传感器命名为pglcd-xy-sfgfp。
4、在本专利技术的一种实施方式中，乙醇酸浓度为0-50mm时，应用于pglcd-xy-sfgfp进行检测。
5、在本专利技术的一种实施方式中，所述修改的乙醇酸传感器文库的基本表达水平分布为339-43786，最高表达水平分布为348-91075。
6、在本专利技术的一种实施方式中，选择与原乙醇酸生产质粒启动子基本表达水平相似或更强的乙醇酸传感器应用于乙醇酸的生产中，所选择用于乙醇酸生产的乙醇酸传感器位于图2，这些传感器的乙醇酸-荧光响应曲线位于图3。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所有动态放大生产乙醇酸的菌株位于表1，所有动态放大生产乙醇酸菌株的摇瓶发酵结果位于图4中a，所用的引物位于表2。
8、在本专利技术的一种实施方式中，菌株乙醇酸产量与传感器的基本表达水平和激活表达水平之间的关系位于图4中的b～e。
9、在本专利技术的一种实施方式中，通过过表达转氢酶基因pntab和敲除转氢酶基因stha提高了nadph的供给，通过调整ed途径的表达强度进一步的提高了nadph的供给，从而提高工程菌株乙醇酸产量。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述乙醇酸代谢途径相关产物包括但不限于乙酸。
11、本专利技术提供了发酵生产乙醇酸的方法。
12、将大肠杆菌工程菌置于30-40℃下培养10-24h，按照1-3％的接种量转入装有50mlm9改良培养基的250ml三角瓶中，置于30-40℃，转速200-250r/min，摇瓶发酵生产乙醇酸。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述的m9改良培养基按g/l计，含有：na2hpo4 6～10，kh2po4 2～6，nh4cl 0.5～3，nacl 0.5～12，mgso4 0.15～1，cacl2 0.1～1，胰蛋白胨7～20，酵母粉2～10，葡萄糖6～8。
14、优选的，本专利技术的培养基：所述的m9改良培养基按g/l计，含有：na2hpo4 6～8，kh2po4 2～4，nh4cl 1～2，nacl 0.5～2，mgso4 0.15～1，cacl2 0.1～1，胰蛋白胨8～10，酵母粉4～6，葡萄糖6～8。
15、本专利技术还提供所述的大肠杆菌工程菌或所述的方法在发酵制备乙醇酸或含有乙醇酸的产品方面的应用。
16、本专利技术提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌是以mgly6为底盘细胞，所述mgly6为敲除了ldha,glcb,aceb,alda,glcdef的大肠杆菌e.coli mg1655，进行下述(a)～(g)任一改造：
17、(a)敲除了底盘细胞基因组上glcc基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因；
18、(b)敲除了底盘细胞基因组上glcc基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因；
19、(c)敲除了底盘细胞基因组上的glcc基因和stha基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因；
20、(d)敲除了底盘细胞基因组上的glcc基因和stha基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因、pj23102-ecedd基因、eceda基因；
21、(e)敲除了底盘细胞基因组上的glcc基因和stha基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因、pj23105-zmedd基因、zmeda基因；
22、(f)敲除了底盘细胞基因组上的glcc基因和stha基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因、pj23102-zmedd基因、zmeda基因；
23、(g)敲除了底盘细胞基因组上的glcc基因和stha基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因、pj23106-zmedd基因、zmeda基因；
24、所述glcc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述stha基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述pntab基因的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述pj23102-ecedd基因的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述eceda基因的核苷酸序列如seq id no.8所示，pj23105-zmedd基因的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述zmeda基因的核苷酸序列如seqid no.10所示，所述pj23102-zmedd基因的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述pj23106-zm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以Mgly6为底盘细胞，进行下述(a)～(g)任一改造：
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是采用pCDF-Duet-1、pTrc99A、pACYC-Duet-1为表达载体。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述gltA基因由核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的启动子PglcD-B1控制表达。
4.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述ycdW基因、aceA基因、pntAB基因是由核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的PglcD-B1启动子控制表达。
5.根据权利要求1～4任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述glcC基因由核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的Pffs控制表达。
6.一种微生物发酵生产乙醇酸的方法，其特征在于所述方法是将权利要求1～5任一所述的基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述发酵培养基按g/L计，含有Na2HPO4 6
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为30～40℃，发酵时间20～72h。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述发酵的转速为200-800r/min。
10.权利要求1～5任一所述基因工程菌或权利要求6～9任一所述方法在制备乙醇酸或含乙醇酸产品方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以mgly6为底盘细胞，进行下述(a)～(g)任一改造：
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是采用pcdf-duet-1、ptrc99a、pacyc-duet-1为表达载体。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述glta基因由核苷酸序列如seq id no.5所示的启动子pglcd-b1控制表达。
4.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述ycdw基因、acea基因、pntab基因是由核苷酸序列如seq id no.5所示的pglcd-b1启动子控制表达。
5.根据权利要求1～4任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述glcc基因由核苷酸序列如seq id no.16所示的...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，周胜虎，杨海宁，李国辉，毛银，赵运英，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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