【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及植物抗病性和农作物的改良领域，特别是涉及用于鉴定感兴趣的农作物中针对植物病原体的植物抗病基因的方法。
技术介绍
1、植物病害导致农业产量大幅下滑。最具破坏性的病害是丝状植物病原体，最值得注意的是真菌和卵菌。这些有害生物是种植者面临的关键挑战，并造成了巨大的管理成本。管理这些病害的最具成本效益和环境友好的方式是使用抗性基因，这些基因通常可能在农作物的野生近缘种或甚至不相关的植物物种中找到。驯化的农作物的野生近缘种含有许多有用的抗病(r)基因。引入这种天然抗性是管理病害的精妙方式。然而，引入r基因的传统方法典型地涉及长久育种轨迹，以避免“连锁累赘”，即与r基因同时引入有害的性状。此外，当一次部署一个基因时，r基因往往会在几个季节内被病原体克服。
2、防止病原体快速克服单个r基因提供的抗性的方法是在农作物中同时部署多个针对病原体的r基因。尽管这种方法能够通过传统的植物育种方法来实现，但很可能会发现多个r基因散布在感兴趣的植物的整个基因组中，这使得将多个r基因组合到单个植物中非常费力且耗时。此外，如果控制多种病原体对确保成功收获至关重要，则这项任务将变得更具挑战性。备选地，可以使用转基因方法将多个r基因快速部署到单个农作物中。通过常规基因工程技术，能够将多个r基因作为转基因导入单个农作物。优选地，将多个r基因作为单个多转基因盒引入，该多转基因盒作为单个基因座分离，以促进多个r基因向育种系和农作物栽培品种的快速转移。
3、尽管测序技术和生物学上的见解取得了巨大进步，但r基因的传统图位克隆仍然具有挑战性
4、最近，mutrenseq被开发以用于在没有其它基于图位的遗传学的情况下鉴定特异性针对感兴趣的植物病害的r基因(steuernagel等人，2017，methods mol.biol.1659:215-229)。虽然mutrenseq已被证明可用于从包含对感兴趣的植物病害的抗性的植物中鉴定nlr基因，但是该方法取决于通过诱变对感兴趣的病害具有抗性的植物来产生易感植物，然后比较来自抗性植物和易感植物的nlr基因的核苷酸序列，以鉴定在易感植物中经修饰的nlr基因。然而，由于产生这种易感植物可能具有挑战性，因此用于鉴定针对感兴趣的病害的r基因的新方法限制了潜在的候选r基因的数量，并且不依赖于通过诱变携带针对感兴趣的病害的r基因的植物产生易感植物。
技术实现思路
1、本专利技术提供了针对一种或多种感兴趣的植物病原体的候选植物抗病(r)基因的文库的制备方法，所述r基因尤其是编码核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列(nlr)的蛋白的r基因。所述方法包括从一种或多种感兴趣的植物中的每一种植物中在一种或多种植物的器官或其它部分中组成性表达的核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列基因(nlr)的群体中选择高度表达的nlr亚群，以产生候选r基因的文库。高度表达的nlr的亚群包含在没有植物或其任何器官或其它部分与一种或多种感兴趣的植物病原体接触或以其它方式暴露于一种或多种感兴趣的植物病原体的情况下在所述植物的器官或其它部分中组成性高度表达的nlr。这种高度表达的nlr是这样的nlr，所述nlr包含的在植物的器官或其它部分中的相对表达水平大于在植物的器官或其他部分中组成性表达的nlr群体中至少约65％的nlr在植物的器官或其它部分中的相对表达水平。
2、本专利技术进一步提供了用于鉴定能够赋予植物对感兴趣的植物病原体抗性的r基因的方法。这些方法包括将包含候选r基因的转基因植物或每个转基因植物包含候选r基因的转基因植物集合与感兴趣的植物病原体接触。候选r基因来自如上所述产生的候选r基因的文库。每种这样的转基因植物都能够通过用候选r基因转化宿主植物来产生。宿主植物是感兴趣的植物病原体的宿主(即易感植物)。也就是说，植物病原体能够在适当的环境条件下在宿主植物上引起植物病害症状。这些方法进一步包括在适合在易感植物上发展病害症状的环境条件下，将转基因植物与感兴趣的植物病原体接触或以其它方式将转基因植物暴露于感兴趣的植物病原体，并确定与不包含候选nlr基因的对照宿主植物相比，转基因植物是否对感兴趣的植物病原体表现出增强的抗性。赋予这种转基因植物对由感兴趣的植物病原体引起的植物病害症状的抗性的候选nlr基因被鉴定为功能性nlr基因。
3、进一步提供了包含候选nlr基因的文库、包含候选nlr基因的转基因植物集合、包含根据本专利技术方法鉴定的一个或多个nlr基因的核酸分子以及包含一个或多个此类nlr基因的植物、植物细胞和其它宿主细胞。
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1.一种制备针对至少一种感兴趣的植物病原体的候选植物抗病(R)基因的文库的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中组成性表达的NLR群体中的一个或多个所述NLR进一步包含至少一个感兴趣的特征。
3.根据权利要求1所述的方法，其中选择高度表达的NLR的亚群进一步包括选择包含至少一个感兴趣的特征的NLR。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述至少一个感兴趣的特征选自由以下组成的组：
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述NLR的表达水平是使用能够用于确定基因相对表达水平的转录组分析方法确定的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录组分析方法是RNA测序(RNAseq)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在选择高度表达的NLR的亚群之前从植物的器官或其它部分分离RNA。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中感兴趣的一种或多种植物不支持一种或多种感兴趣的植物病原体的生长或生命周期的完成。
9.根据权利要求1-9中任一
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括用候选R基因的文库中的候选NLR转化宿主植物，其中所述宿主植物是至少一种感兴趣的病原体的宿主。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述宿主植物选自由小麦、大麦、水稻、黑麦、玉米、高粱、燕麦、大豆、马铃薯、番茄、甘薯、棉花、甘蔗和木薯组成的组。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述感兴趣的植物是与宿主植物相同的物种。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述感兴趣的植物与宿主植物不是同一物种。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述感兴趣的植物与宿主植物来自同一科、亚科、族和/或属。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述器官是叶。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述感兴趣的植物病原体是小麦的叶片病原体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述感兴趣的植物病原体选自由柄锈菌属(Puccinia)和稻瘟菌属(Magnaporthe)小麦病原体组成的组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述感兴趣的植物病原体选自由小麦秆锈菌(Puccinia graminis f.sp.Tritici)、小麦条锈菌(Puccinia striiformisf.sp.Tritici)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina)和小麦型稻瘟病菌(Magnaportheoryzae Triticum)组成的组。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述宿主植物是小麦。
20.根据权利要求19所述的方法，其中一种或多种感兴趣的植物是禾本科(Poaceae)中的物种。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述禾本科中的物种选自由以下物种组成的组：芨芨草属(Achnatherum)，山羊草属(Aegilops)，冰草属(Agropyron)，燕麦属(Avena)，短柄草属(Brachypodium)，凌风草属(Briza)，洋狗尾草属(Cynosurus)，猬禾属(Echinaria)，绒毛草属(Holcus)，大麦属(Hordeum)，草属(Koeleria)，黑麦草属(Lolium)，臭草属(Melica)，虉草属(Phalaris)和早熟禾属(Poa)。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述禾本科中的物种选自由以下组成的组：印度落芒草(Achnatherum hymenoides)，双角山羊草(Aegilops bicornis)，高大山羊草(Aegilops longissima)，西尔斯山羊草(Aegilops searsii)、沙融山羊草(Aegilopssharonensis)，冰草(Agropyron cristatum)，埃塞俄比亚燕麦(Avena abyssinica)，二穗短柄草(Brachypodium distachyon)，凌风草(Briza media)，洋狗尾草(Cynosuruscristatus)，Echinaria capitata，绒毛草(Holcus lanatus)，大麦(Hordeum vulgare)，草(Koeleria macrantha)，黑麦草(Lolium perenne)，小穗臭草(Melica ciliate)，天蓝虉草(Phalaris coerulesce...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种制备针对至少一种感兴趣的植物病原体的候选植物抗病(r)基因的文库的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中组成性表达的nlr群体中的一个或多个所述nlr进一步包含至少一个感兴趣的特征。
3.根据权利要求1所述的方法，其中选择高度表达的nlr的亚群进一步包括选择包含至少一个感兴趣的特征的nlr。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述至少一个感兴趣的特征选自由以下组成的组：
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述nlr的表达水平是使用能够用于确定基因相对表达水平的转录组分析方法确定的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录组分析方法是rna测序(rnaseq)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在选择高度表达的nlr的亚群之前从植物的器官或其它部分分离rna。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中感兴趣的一种或多种植物不支持一种或多种感兴趣的植物病原体的生长或生命周期的完成。
9.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述器官选自由叶、根和茎组成的组。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括用候选r基因的文库中的候选nlr转化宿主植物，其中所述宿主植物是至少一种感兴趣的病原体的宿主。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述宿主植物选自由小麦、大麦、水稻、黑麦、玉米、高粱、燕麦、大豆、马铃薯、番茄、甘薯、棉花、甘蔗和木薯组成的组。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述感兴趣的植物是与宿主植物相同的物种。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述感兴趣的植物与宿主植物不是同一物种。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述感兴趣的植物与宿主植物来自同一科、亚科、族和/或属。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述器官是叶。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述感兴趣的植物病原体是小麦的叶片病原体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述感兴趣的植物病原体选自由柄锈菌属(puccinia)和稻瘟菌属(magnaporthe)小麦病原体组成的组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述感兴趣的植物病原体选自由小麦秆锈菌(puccinia graminis f.sp.tritici)、小麦条锈菌(puccinia striiformisf.sp.tritici)、小麦叶锈菌(puccinia triticina)和小麦型稻瘟病菌(magnaportheoryzae triticum)组成的组。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述宿主植物是小麦。
20.根据权利要求19所述的方法，其中一种或多种感兴趣的植物是禾本科(poaceae)中的物种。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述禾本科中的物种选自由以下物种组成的组：芨芨草属(achnatherum)，山羊草属(aegilops)，冰草属(agropyron)，燕麦属(avena)，短柄草属(brachypodium)，凌风草属(briza)，洋狗尾草属(cynosurus)，猬禾属(echinaria)，绒毛草属(holcus)，大麦属(hordeum)，草属(koeleria)，黑麦草属(lolium)，臭草属(melica)，虉草属(phalaris)和早熟禾属(poa)。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述禾本科中的物种选自由以下组成的组：印度落芒草(achnatherum hymenoides)，双角山羊草(aegilops bicornis)，高大山羊草(aegilops longissima)，西尔斯山羊草(aegilops searsii)、沙融山羊草(aegilopssharonensis)，冰草(agropyron cristatum)，埃塞俄比亚燕麦(avena abyssinica)，二穗短柄草(brachypodium distachyon)，凌风草(briza media)，洋狗尾草(cynosuruscristatus)，echinaria capitata，绒毛草(holcus lanatus)，大麦(hordeum vulgare)，草(koeleria macrantha)，黑麦草(lolium perenne)，小穗臭草(melica ciliate)，天蓝虉草(phalaris coerulescens)和普通早熟禾(poa trivialis)。
23.通过权利要求1-22中任一项所述的方法制备的候...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·莫斯寇，H·P·梵艾瑟，
申请(专利权)人：双刃基金会，
类型：发明
国别省市：
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