【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米材料的制备及应用领域，具体涉及一种水溶性铜掺杂叶酸纳米酶（cf nanozyme）的制备方法及其在增强肿瘤治疗方面的应用。
技术介绍
1、癌症是威胁人类健康的问题之一。传统的化疗、手术、放疗等治疗方法创伤大、毒副作用大、易引发耐药，迫使人类不断寻找新的治疗方法。光动力疗法 (pdt)、光热疗法(ptt) 和化学动力疗法 (cdt)是近年来发展起来的治疗癌症的新方法，分别依靠产生单线态氧、光热效应、羟基自由基来杀死肿瘤细胞，这些治疗方法具有更高的选择性，更低的毒性，更好的治疗效果。由于肿瘤微环境 (tme) 处于过度增殖的代偿状态，导致肿瘤区域乏氧，这不利于光动力治疗。同时，过度的氧化应激也使肿瘤微环境始终处于高水平过氧化氢的状态，这会导致持续的氧胁迫造成 dna 损伤，加剧正常细胞恶性转化，增加肿瘤细胞的浸润及转移，这不利于癌症的治疗。此外，肿瘤细胞中过量的 gsh 会消耗 ros，降低cdt和pdt的作用。因此迫切需要一种多维多效地改善癌症治疗的方法，通过改善肿瘤微环境的乏氧状态，减少过氧化氢及谷胱甘肽水平来提高光动力疗法、光热疗法和化学动力疗法的肿瘤治疗效果。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于克服现有技术的不足，提供了一种铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法及其应用，由叶酸和铜离子通过水热合成法制备铜掺杂叶酸纳米酶（cf nanozyme），粒径小，大小均一，具有优秀的光热效应、过氧化氢酶、过氧化物酶、氧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，同时以叶酸为原料赋予纳米酶肿瘤靶
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、一种铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，具体包括如下步骤：
4、（1）将叶酸和可溶性铜盐溶于水中，加氢氧化钠调节ph至碱性得到溶液ⅰ；
5、其中，可溶性铜盐包括氯化铜，硝酸铜，硫酸铜，碳酸铜中的一种。溶液ⅰ的 ph 为8～12。溶液ⅰ中的叶酸的浓度为 0.1 mg/ml ~ 1 mg/ml，可溶性铜盐的浓度为 0.1 mg/ml ~1 mg/ml。叶酸:铜离子的物质量之比约为1 ~ 4：1 ~ 10。
6、（2）将溶液ⅰ进行超声处理，加入水热合成釜中，并水热反应后得到溶液ⅱ；
7、其中，溶液ⅰ的超声时间为 10 ~ 20 min。水热反应的温度为 90 ~ 200 ºc，时间为 2 h ~ 10 h。
8、（3）待溶液ⅱ冷却至室温后，离心得沉淀，并反复洗涤后用纯化水复溶，最后冷冻干燥得到cf nanozyme固体颗粒。
9、其中，溶液ⅱ离心处理，离心转速为12000 r/min，时间为 10 ~15 min。溶液ⅱ离心后取下层沉淀进行洗涤，复溶并冻干。
10、本专利技术所制备的铜掺杂叶酸纳米酶，其尺寸在50 ~ 300纳米。
11、本专利技术还提供了上述cf nanozyme在增强肿瘤治疗效果中的应用。得益于叶酸的靶向作用，cf nanozyme可以通过与叶酸受体结合靶向肿瘤细胞，表现出优秀的肿瘤区域聚集效应。cf nanozyme具有良好的光热效应，可实现肿瘤的光热治疗。同时，cf nanozyme具有优秀的过氧化氢酶 (cat) 活性和过氧化物酶 (pod) 活性，前者可催化肿瘤区域过度表达的过氧化氢分解产生氧气，以改善肿瘤区域的乏氧状态，后者可催化过度表达的过氧化氢分解产生活性氧 (ros) — 羟基自由基，达到对肿瘤细胞的杀伤作用。cf nanozyme还具有另一氧化酶 (oxd) 活性，可催化氧原子产生另一活性氧 (ros) — 单线态氧，这种活性氧也可对肿瘤造成杀伤作用。此外，cf nanozyme还具有优秀的谷胱甘肽过氧化物酶 (gpx)活性，可消耗肿瘤区域过表达的谷胱甘肽，显著增强肿瘤治疗效果。
12、本专利技术提供的纳米酶的过氧化氢酶活性是通过检测不同材料浓度下，10 mm h2o2 体系所产生 o2 的量来评价，在10 min 内，20 μg/ml的cf nanozyme可使体系 o2 含量达到19 mg/l，然而叶酸和铜离子对照组则没有明显的氧气产生，说明纳米酶具有优秀的过氧化氢酶活性，这可有效缓解肿瘤微环境的高h2o2 水平和乏氧状态，同时这也有助于癌症的光动力治疗。
13、本专利技术提供的纳米酶的过氧化物酶活性是通过羟基自由基检测试剂亚甲基蓝(mb) 检测结果来评价的，具体为：向含有mb和10 mm h2o2 体系中加入cf nanozyme，反应20 min后检测混合液的紫外全波长吸收，同时设立叶酸和铜离子的对照组。已知亚甲基蓝(mb)可以被高活性的羟基自由基氧化，导致650 nm处的紫外特征吸收下降。cf nanozyme可在短时间内催化 h2o2 产生大量羟基自由基，并使mb被氧化，使mb在紫外650 nm处的吸收峰下降，而叶酸和铜离子的对照组则没有表现出明显的特征峰下降，说明cf nanozyme具有优秀的过氧化物酶活性，显示了cf nanozyme在癌症化学动力学治疗中的潜力。
14、本专利技术提供的纳米酶的氧化酶活性是通过检测单线态氧检测试剂1,3-二苯基异苯并呋喃 (dpbf) 与纳米酶混合后的紫外特征吸收变化来评价的，50 μg/ml的纳米酶与dpbf混合30min后可将dpbf在415 nm的特征吸收快速下降，60min甚至可以让dpbf的特征吸收完全消失，然而叶酸和铜离子对照组中dpbf的特征吸收只有小幅变化，说明纳米酶可催化环境中的氧原子产生大量单线态氧，单线态氧对肿瘤细胞具显著的杀伤作用，是纳米酶杀伤肿瘤细胞的方式之一。
15、本专利技术提供的纳米酶的谷胱甘肽过氧化物酶活性是通过检测不同材料浓度及反应时间影响下，200 μm谷胱甘肽体系中谷胱甘肽检测试剂dtnb的紫外特征吸收变化来衡量的。30 μg/ml的cf nanozyme可使体系中的谷胱甘肽在5 min内得到快速清除。而10 μg/ml的cf nanozyme可随时间不断清除体系中的谷胱甘肽，并在20 min时使体系中的谷胱甘肽含量得到显著降低。这体现了cf nanozyme优秀的谷胱甘肽过氧化物酶活性，可用于缓解肿瘤微环境谷胱甘肽的过度表达并提高光动力疗法及化学动力学疗法在癌症治疗中的治疗效果。
16、本专利技术的有益效果：
17、本专利技术利用氢氧化钠溶液调节叶酸、氯化铜混合溶液的酸碱度并对其进行超声处理。一方面碱性条件增加了叶酸在水中的溶解度，使叶酸得到更好的分散，另一方面经过超声处理后，溶液整体更加均一分散，这利于下一步水热合成反应充分进行。反应温度为 180℃左右，时间为 8 h左右，这有利于铜离子与叶酸中的氨基官能团有效配位，提高了资源的利用效率，使反应拥有较高的产率。制备过程使用水热合成方法，操作简单易行。制备好的纳米酶具有较小的粒径，平均直本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，叶酸与可溶性铜盐的物质的量之比为1~4：1~10。
3.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中的叶酸的浓度为0.1mg/mL~1mg/mL，可溶性铜盐的浓度为0.1mg/mL~1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，所述混合溶液的pH为8～12。
5.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，混合溶液的超声处理时间为10~20min。
6.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，水热反应的温度为90~200ºC，反应时间为2 h~10 h。
7.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，可溶性铜盐包括氯化铜，硝酸铜，硫酸铜，碳酸铜中的一种。
8.一种如权利要求1-7任一项所述方法制备的铜掺杂叶酸纳米酶，其特征在于，所述铜掺杂叶酸纳米酶的尺寸在
9.一种如权利要求8所述的铜掺杂叶酸纳米酶的应用，其特征在于，所述铜掺杂叶酸纳米酶在制备肿瘤辅助治疗药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，叶酸与可溶性铜盐的物质的量之比为1~4：1~10。
3.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中的叶酸的浓度为0.1mg/ml~1mg/ml，可溶性铜盐的浓度为0.1mg/ml~1mg/ml。
4.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，所述混合溶液的ph为8～12。
5.根据权利要求1所述的铜掺杂叶酸纳米酶的制备方法，其特征在于，混合溶液...
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