【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种hspb6基因敲除细胞系的构建方法及其应用。
技术介绍
1、遗传性骨病(genetic skeletal disorders，gsd)是一类具有遗传异质性的软骨发育障碍性疾病，主要包括软骨发育不全(achondroplasia，ach)、软骨发育低下(hypochondroplasia，hch)和致死性骨发育不全(thanatophoric dysplasia，td)，导致患儿严重的身体残疾，甚至早年夭折，危害严重。因此，深入了解gsd的发病机制和探索有效分子靶点具有重要意义。
2、热休克蛋白6(heat shock protein b6，hspb6)，也称为hsp20，是一种17kda的蛋白质，属于小热休克蛋白家族。hspb6在多种组织中组成型表达，而在骨骼肌、心肌和平滑肌中呈高水平表达。目前，hspb6在gsd发生中的分子机制，尤其是其介导软骨细胞自噬的作用仍有待阐明。
3、crispr/cas9系统是原核生物的一种天然免疫系统。作为基因组靶向敲除和敲入的遗传学手段，是继zfn、talens等技术后的第三代基因编辑技术。通过人工设计的sgrna(guide rna)来识别目的基因组序列，并引导cas9蛋白酶进行有效切割dna双链，形成双链断裂，dna损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组dna修饰的目的。由于crispr/cas9系统具有高效率、简单操作、低成本等特点，成为当今最具应用前景的基因编辑系统。然而，利用crispr/cas9技术靶向敲除hsp
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提出了一种hspb6基因敲除细胞系的构建方法及其应用。
2、为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种利用crispr-cas9技术构建hspb6基因敲除细胞系的方法，以hspb6基因的序列中seq id no：1～3为靶序列。
3、根据本专利技术的实施例，采用靶序列为人hspb6基因第3外显子的三种不同sgrna，这些sgrna可用于特异性识别hspb6基因、敲除hspb6基因和构建hspb6基因敲除的细胞系产品，有利于研究hspb6表达调控对细胞功能的影响；构建的hspb6基因敲除细胞系通过影响软骨细胞自噬，使得该细胞系可用于研究hspb6在gsd发生中的分子机制。
4、根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：
5、(1)构建hspb6基因敲除质粒hspb6-sgrna1、hspb6-sgrna2、hspb6-sgrna3；
6、(2)将上步所得的质粒进行慢病毒包装，获得hspb6基因敲除慢病毒；
7、(3)使用所述hspb6基因敲除慢病毒感染atdc5靶细胞，得到hspb6基因敲除细胞系atdc5-hspb6-sgrna1、atdc5-hspb6-sgrna2、atdc5-hspb6-sgrna3。
8、进一步地，所述质粒选自lentilcrispr v2；所述慢病毒选自hek293t，所述慢病毒包装采用的质粒选自pspax2和pmd2.g。
9、在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种质粒，所述质粒为上述的hspb6-sgrna1、hspb6-sgrna2、hspb6-sgrna3。
10、在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种成套质粒，所述成套质粒由pspax2质粒、pmd2.g质粒和上述的hspb6-sgrna1质粒组成；或者由pspax2质粒、pmd2.g质粒和上述的hspb6-sgrna2质粒组成；或者由pspax2质粒、pmd2.g质粒和上述的hspb6-sgrna3质粒组成。
11、在本专利技术的第四方面，本专利技术提出上述成套质粒的用途，所述用途为基于crispr-cas9技术敲除atdc5靶细胞中的hspb6基因。
12、在本专利技术的第五方面，本专利技术提出一种细胞系，所述细胞系中hspb6基因敲除，所述细胞系是通过上述构建细胞系的方法获得的。由此，构建的hspb6基因敲除细胞系通过影响软骨细胞自噬，使得该细胞系可用于研究hspb6在gsd发生中的分子机制。
13、在本专利技术的第六方面，本专利技术提出上述细胞系的用途，所述细胞系用于研究hspb6在gsd发生中的分子机制。
14、本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
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1.一种利用CRISPR-Cas9技术构建HSPB6基因敲除细胞系的方法，其特征在于，以HSPB6基因的序列中SEQ ID NO：1～3为靶序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质粒选自lentilCRISPR v2；所述慢病毒选自HEK293T，所述慢病毒包装采用的质粒选自psPAX2和pMD2.G。
4.一种质粒，其特征在于，所述质粒为权利要求2中所述的HSPB6-sgRNA1、HSPB6-sgRNA2、HSPB6-sgRNA3。
5.一种成套质粒，其特征在于，所述成套质粒由psPAX2质粒、pMD2.G质粒和权利要求2中所述的HSPB6-sgRNA1质粒组成；或者由psPAX2质粒、pMD2.G质粒和权利要求2中所述的HSPB6-sgRNA2质粒组成；或者由psPAX2质粒、pMD2.G质粒和权利要求2中所述的HSPB6-sgRNA3质粒组成。
6.权利要求5所述的成套质粒的用途，其特征在于，所述用途为基于CRISPR-Cas9技术敲除ATDC5
7.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系中HSPB6基因敲除，所述细胞系是通过权利要求1-3中任一项构建细胞系的方法获得的。
8.如权利要求7所述的细胞系的用途，其特征在于，所述细胞系用于研究HSPB6在GSD发生中的分子机制。
...【技术特征摘要】
1.一种利用crispr-cas9技术构建hspb6基因敲除细胞系的方法，其特征在于，以hspb6基因的序列中seq id no：1～3为靶序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质粒选自lentilcrispr v2；所述慢病毒选自hek293t，所述慢病毒包装采用的质粒选自pspax2和pmd2.g。
4.一种质粒，其特征在于，所述质粒为权利要求2中所述的hspb6-sgrna1、hspb6-sgrna2、hspb6-sgrna3。
5.一种成套质粒，其特征在于，所述成套质粒由pspax2质粒、pmd2.g质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晶，车琳，
申请(专利权)人：厦门市妇幼保健院厦门市优生优育服务中心，厦门大学附属妇女儿童医院，厦门市林巧稚妇女儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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