【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学或生物制药，尤其是涉及一种人源化抗robo1纳米抗体及其应用。
技术介绍
1、在脊椎动物和无脊椎动物的神经系统发育过程中，涉及几个主要由轴突引导分子驱动的进行性和递归性的过程，如slit和round about(robo)。slit蛋白是高度保守、分泌型的糖蛋白，通过与跨膜受体结合介导其功能；robo为slit的受体，是一种进化保守的跨膜受体igg超家族。其家族成员包括robo1，robo2，robo3，robo4。slit/robo信号通路首先被确立为指导轴突途径发现、促进轴突分支和控制神经元迁移的胞外标记物。slit/robo蛋白的相互作用与乳腺、肺、肝、肾、眼和生殖系统等重要器官的发育过程密切相关。近些年来，越来越多的研究表明，slit/robo信号在不同类型的癌症形成中还发挥作用，同时参与致癌信号通路的调控，包括轴突引导、细胞增殖、细胞运动和血管生成等等，该信号在细胞中的异常表达可导致癌症的恶化和转移。
2、近年来，免疫细胞治疗行业在生物医药领域中的发展已经出现急剧的增长，该疗法是采用人体自身或者供者来源的免疫细胞，在体外通过一定的操作手段，再输入到患者体内，从而达到肿瘤治疗的目的。其中，工程免疫细胞疗法中主要代表有以car-t、tcr-t、car-nk、car-m等不同的项目。
3、同时，纳米抗体与常规抗体相比的优势主要有：1.分子量小，在体内更容易穿透血脑屏障；2.特异性强，亲和力高；3.与人抗体序列同源性高，对人的免疫原性相对较弱。目前也被广泛应用在基因工程药物的研发中
4、但目前，还缺少人源化的robo1纳米抗体，抗robo1纳米抗体还有待进一步开发，来获得对人源robo1抗原具有高亲和力、高特异性且具有低robo1种属交叉反应的人源化抗robo1纳米抗体。
5、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种靶向人源robo1的人源化纳米抗体，期望该人源化纳米抗体能够弥补人源化robo1纳米抗体的空白，并能够进一步用于构建抗robo1抗体或其抗原结合片段、抗robo1 car细胞、药物和诊断试剂盒。
2、为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
3、根据本专利技术的一个方面，提供了一种人源化抗robo1纳米抗体，所述人源化抗robo1纳米抗体的可变区含有与robo1特异性结合的互补决定域cdr1～cdr3和连接互补决定域cdr1～cdr3的骨架片段fr1～4；
4、cdr1为：gytpsryc；
5、cdr2为：iesgtgtl；
6、cdr3为：arttdsrclhssywyrpglydywg或aattdsrclhssywyrpglydywg；
7、连接互补决定域cdr1～cdr3的骨架片段fr1～4选自如下fr，或与下述氨基酸序列的框架fr具有至少80％的序列同一性，并且，与所述互补决定域组合后与robo1具有kd≤10-7mol/l的结合力的框架fr；
8、fr1为evqlvesggglvqpggslrlscaas；
9、fr2为m-g-w-f-r-q-a-p-g-k-e-r-e-x1-v-x2-g，其中x1为w或g，x2为s或a；
10、fr3为v-y-a-d-s-v-k-g-r-f-t-i-s-r-d-n-a-k-x3-s-l-y-l-q-m-n-s-l-r-a-e-d-t-a-x4-y-y-c，其中x3为n或k，x4为v或m；
11、fr4为qgtlvtvss。
12、根据本专利技术的另一个方面，还提供了抗robo1抗体或其抗原结合片段，其含有上述人源化抗robo1纳米抗体，或，含有上述人源化抗robo1纳米抗体中的可变区。
13、根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种生物材料，包括(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：
14、(ⅰ)核酸分子，包括编码上述人源化抗robo1纳米抗体，或上述抗robo1抗体或其抗原结合片段；
15、(ⅱ)载体，所述载体携带所述(ⅰ)核酸分子；
16、(ⅲ)细胞，所述细胞携带所述(ⅰ)核酸分子，或含有所述(ⅱ)载体，或表达上述人源化抗robo1纳米抗体，或上述抗robo1抗体或其抗原结合片段。
17、根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种抗robo1 car细胞，所述抗robo1 car细胞的嵌合抗原受体包含上述人源化抗robo1纳米抗体，或上述抗robo1抗体或其抗原结合片段。
18、根据本专利技术的另一个方面，还提供了上述人源化抗robo1纳米抗体，或上述抗robo1抗体或其抗原结合片段，或上述生物材料，或上述抗robo1 car细胞在制备细胞药物、抗体药物或诊断试剂盒中的应用。
19、根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种体外检测robo1的制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒包含上述人源化抗robo1纳米抗体，或上述抗robo1抗体或其抗原结合片段，或上述生物材料。
20、根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种药物组合物，包含上述人源化抗robo1纳米抗体，或上述抗robo1抗体或其抗原结合片段，或上述生物材料，或上述抗robo1 car细胞。
21、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
22、以robo1分子为靶点，采用羊驼免疫，噬菌体筛选的策略筛选靶点特异性纳米抗体。将筛选得到的一株纳米抗体vhh-2h，以cdr嫁接结合回复突变的方法对纳米抗体vhh-2h进行人源化改造，得到多条人源化抗robo1纳米抗体的可变区序列。经验证，本专利技术提供的纳米抗体vhh-2h经过人源化后保持了亲本抗体的结合能力，与人robo1有特异性结合，与人robo2～4无结合。与人、猴和大鼠(rat)的robo1有特异性结合，与兔，狗和小鼠(mouse)robo1有微弱结合。
23、本专利技术提供的人源化抗robo1纳米抗体弥补了robo1靶点检测在纳米抗体领域的空缺。将本专利技术提供的人源化抗robo1纳米抗体应用于临床并进入市场，对开发更多的关于癌症的药物具有巨大的潜能和前景。
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1.人源化抗ROBO1纳米抗体，其特征在于，所述人源化抗ROBO1纳米抗体的可变区含有与ROBO1特异性结合的互补决定域CDR1～CDR3和连接互补决定域CDR1～CDR3的骨架片段FR1～4；
2.根据权利要求1所述人源化抗ROBO1纳米抗体，其特征在于，所述FR2选自SEQ IDNO.9～11中任意一种；且所述FR3选自SEQ ID NO.12～14中任意一种；
3.根据权利要求1所述人源化抗ROBO1纳米抗体，其特征在于，还含有(ⅰ)和/或(ⅱ)：
4.根据权利要求1～3任一项所述的人源化抗ROBO1纳米抗体，其特征在于，包括单价纳米抗体、双价纳米抗体、多价纳米抗体或双特异性纳米抗体。
5.抗ROBO1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，含有权利要求1～4任一项所述的人源化抗ROBO1纳米抗体，或，含有权利要求1～4任一项中所述的可变区。
6.根据权利要求5所述的抗ROBO1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗ROBO1抗体或其抗原结合片段选自scFv分子、Fv分子、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、
7.生物材料，其特征在于，包括(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：
8.抗ROBO1 CAR细胞，其特征在于，所述抗ROBO1 CAR细胞的嵌合抗原受体包含权利要求1～4任一项所述的人源化抗ROBO1纳米抗体，或权利要求5或6所述的抗ROBO1抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求1～4任一项所述的人源化抗ROBO1纳米抗体，或权利要求5或6所述的抗ROBO1抗体或其抗原结合片段，或权利要求7的生物材料，或权利要求8所述的抗ROBO1 CAR细胞在制备细胞药物、抗体药物或诊断试剂盒中的应用；
10.体外检测ROBO1的制剂或试剂盒，其特征在于，所述制剂或试剂盒包含权利要求1～4任一项所述的人源化抗ROBO1纳米抗体，或权利要求5或6所述的抗ROBO1抗体或其抗原结合片段，或权利要求7的生物材料。
11.药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～4任一项所述的人源化抗ROBO1纳米抗体，或权利要求5或6所述的抗ROBO1抗体或其抗原结合片段，或权利要求7的生物材料，或权利要求8所述的抗ROBO1 CAR细胞。
...【技术特征摘要】
1.人源化抗robo1纳米抗体，其特征在于，所述人源化抗robo1纳米抗体的可变区含有与robo1特异性结合的互补决定域cdr1～cdr3和连接互补决定域cdr1～cdr3的骨架片段fr1～4；
2.根据权利要求1所述人源化抗robo1纳米抗体，其特征在于，所述fr2选自seq idno.9～11中任意一种；且所述fr3选自seq id no.12～14中任意一种；
3.根据权利要求1所述人源化抗robo1纳米抗体，其特征在于，还含有(ⅰ)和/或(ⅱ)：
4.根据权利要求1～3任一项所述的人源化抗robo1纳米抗体，其特征在于，包括单价纳米抗体、双价纳米抗体、多价纳米抗体或双特异性纳米抗体。
5.抗robo1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，含有权利要求1～4任一项所述的人源化抗robo1纳米抗体，或，含有权利要求1～4任一项中所述的可变区。
6.根据权利要求5所述的抗robo1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗robo1抗体或其抗原结合片段选自scfv分子、fv分子、fab片段、fab′片段、f(ab)′2片段、...
【专利技术属性】
技术研发人员：张骏，李华顺，
申请(专利权)人：四川阿思科力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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