【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种通用型耐高温分子诊断酶稀释液及其应用。
技术介绍
1、酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或rna，分子诊断领域中，使用酶多为蛋白质构成。相关产品开发过程中，根据实际使用情况，酶需要在各种极环境下发挥相应功能及作用，对酶的稳定性能提出考验。已有文献报道添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还可提高酶的抗蛋白水解，抗化学试剂，抗ph变化，抗变性剂，抗稀释作用，根据相应文献资料，现对添加剂的组分及比例进行优化调整，发开一种对提升蛋白稳定性具有显著作用的稀释液。
2、ivd(in vitro diagnosis)也是体外诊断，指的是取出人体中的血液、体液、组织等样本进行检测，进而判断疾病或身体功能的诊断方法，从技术分类来看，我国体外诊断市场结构以免疫诊断为主，其他技术依次为临床生化诊断、血液和体液学诊断、分子诊断等。分子诊断以其依托于pcr技术，具备敏度高、特异性强、诊断窗口期短，可进行定性、定量检测，可广泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等，填补了早期免疫检测窗口期的检测空白，为早期诊断、早期治疗、安全用血提供了有效的帮助。
3、pcr是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)的英文缩写，是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，pcr可看作是生物体外的特殊dna复制。随着技术的发展，rt-pcr应运而生。rt-pcr，反转录聚合酶链反应(reverse tra
4、dna聚合酶是分子pcr反应中扩增的核心酶，在后续发展过程中，taq酶是一种来源于耐热性细菌thermus aquaticus的耐热性dna聚合酶，分子量94kda，在镁离子存在的条件下，其最适反应温度为75-80℃，在95℃下的活性半衰期为40分钟，具有5’-3’核酸外切酶活性。由于其具有耐高温的特性，因此广泛用于聚合酶链式反应(pcr)，是核酸扩增、检测等反应的首选用酶。
5、反转录酶(reverse transcriptase)又称逆转录酶。是以rna为模板指导dntp合成互补dna(cdna)的酶。一部分反转录酶具有rna酶活性，能够在转录后降解rna-dna杂交链中的rna链。如果反转录酶没有rnase酶活性，可加入rnaseh来获得更高的qpcr效率。常用的酶包括money鼠白血病病毒(mmlv)反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒(amv)反转录酶。
6、rnase抑制剂是鼠源重组蛋白,分子量为50kda,可以特异性抑制rnasea、b和c活性。它与rnase以1:1的比例高效非共价结合从而抑制其活性。但对rnase 1、rnase t1、s1核酸酶、rnaseh或来源于曲霉属的rnase无效。此外,与下列聚合酶共同使用时,该抑制剂不会抑制聚合酶的活性,如:taq dna聚合酶、amv或m-mulv反转录酶或噬菌体rna聚合酶(sp6、t7或t3)。重组小鼠rnase抑制剂不含有半胱氨酸,已证实,人源中的半胱氨酸能导致抑制剂对氧化敏感甚至失活。因此,小鼠rnase抑制剂与人/猪rnase抑制剂相比,抗氧化能力显著提高,且在dtt浓度较低(<1mm)时更稳定。这使其在不适宜高浓度dtt的反应中更具优势,如实时rt-pcr。
7、尿嘧啶dna糖苷酶(uracil n-glycosylase,ung)又名uracil-dnaglycosylase(udg),为来源于e.coli ung基因的重组表达蛋白,分子量为26kda。它可催化含尿嘧啶的单链和双链dna(长度大于6个碱基)释放游离尿嘧啶,但对rna无活性。ung主要应用于pcr扩增产物的防污染,作用原理为:如果在pcr反应中以dutp替代dttp掺入dna中,形成了含du碱基的pcr扩增产物,该酶能选择性断裂单链和双链dna中u基的糖苷键,降解该pcr扩增产物。
8、荧光热漂移技术(thermal shift assay)：蛋白质通常以native状态存在，加热会导致蛋白质转化为denatured状态，暴露出疏水基团。暴露出的疏水基团可以与荧光染料sypro orange相结合，从而提高荧光染料的发射光，于是可以通过检测荧光强度来反映蛋白质的稳定性。不同温度下，因为蛋白质暴露疏水基团的量不同，荧光的强度也不同，于是可以画出荧光-温度曲线图。当有配体与蛋白质相结合时，蛋白质的稳定性增加，使得相同温度下暴露的疏水基团减少，需要更高的温度来使蛋白质充分暴露疏水基团。于是造成荧光-温度曲线图右移，所以fluorescence-based thermal shift assay也叫做“荧光热漂移实验”。
9、现有技术存在的问题：分子诊断产品在运输过程中，受到组分中各酶稳定性要求限制，必须进行冷链运输，该特性大大增高了运输成本，以及偏远地区运输使用该产品的可能。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种通用型耐高温分子诊断酶稀释液，能够显著提高酶的稳定性和反应效率，具体技术方案如下：
2、1.一种通用型耐高温分子诊断酶稀释液，包括：ph7.8-8.5taps-koh、30％-50％海藻糖、10-30％蔗糖、1-5-mm dtt、1-10％葡聚糖、0.5-5％明胶、50-300mm醋酸钾、100-300mmkcl、1-10mm硫酸铵、0.5％-5％np40、0.5％-5％tritonx-100、0.05-2.0mm edta，溶剂为水。
3、上述组分的优选浓度和参数包括：taps-koh的ph包括：7.8、8.0、8.2、8.5；海藻糖浓度包括：30％、35％、40％、45％、50％；蔗糖浓度包括：10％、15％、20％、25％、30％；dtt浓度包括：1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mm；葡聚糖浓度包括：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％；明胶浓度包括：0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％；醋酸钾浓度包括：50、80、120、150、180、240、280、300mm；kcl浓度包括：100、150、200、250、300mm；硫酸铵浓度包括：1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mm；np40浓度包括：0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、4.5％、5.0％；tritonx-100浓度包括：0.5％、
4、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、4.5％、5.0％；edta浓度包括：0.05、0.1、0.15、2.0mm；上述组分的溶剂为水。
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【技术保护点】
1.一种通用型耐高温分子诊断酶稀释液，其特征在于所述稀释液包括：PH7.8-8.5Taps-KOH、30％-50％海藻糖、10-30％蔗糖、1-5-mM DTT、1-10％葡聚糖、0.5-5％明胶、50-300mM醋酸钾、100-300mM KCl、1-10mM硫酸铵、0.5％-5％NP40、0.5％-5％TritonX-100、0.05-2.0mM EDTA，溶剂为水。
2.一种通用型耐高温分子诊断酶稀释液，其特征在于所述稀释液包括：PH7.8 Taps-KOH、30％海藻糖、10％蔗糖、5mM DTT、1％葡聚糖、0.5％明胶、50mM醋酸钾、100mM KCl、1mM硫酸铵、0.5％NP40、0.5％TritonX-100、0.1mM EDTA。
3.一种通用型耐高温分子诊断酶稀释液配方筛选方法，其特征在于所述方法包括：
4.权利要求1和2中任何一项所述的一种通用型耐高温分子诊断酶稀释液在提高分子诊断酶热稳定性中的应用，其特征在于所述所述酶包括：Taq酶、MMLV酶、RI酶、UDG酶。
【技术特征摘要】
1.一种通用型耐高温分子诊断酶稀释液，其特征在于所述稀释液包括：ph7.8-8.5taps-koh、30％-50％海藻糖、10-30％蔗糖、1-5-mm dtt、1-10％葡聚糖、0.5-5％明胶、50-300mm醋酸钾、100-300mm kcl、1-10mm硫酸铵、0.5％-5％np40、0.5％-5％tritonx-100、0.05-2.0mm edta，溶剂为水。
2.一种通用型耐高温分子诊断酶稀释液，其特征在于所述稀释液包括：ph7.8 tap...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵继光，林黄昱，
申请(专利权)人：厦门宝太元酶生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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