【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用代谢工程技术高效生产依克多因的重组大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程和生物。
技术介绍
1、依克多因(ectoine)是一种氨基酸衍生物，极具亲水性，是一种天然的细胞保护剂和稳定剂，可抵抗高渗透压和高温环境。嗜盐微生物或耐盐微生物可以大量积累依克多因从而适应高盐和高温环境。依克多因可以作用于细胞dna，从而减少紫外线辐射对细胞辐射损伤。依克多因可以抵御高盐、低温、高温、高压、干旱、高紫外线辐射等极端条件，从而使细胞免受伤害。依克多因作为一种功效卓著的抗压保护分子，可以应用于整体细胞防护(渗透压保护；抗逆保护作用；防辐射与保湿作用)。依克多因也是一种多功能的活性成分，可以提升皮肤细胞的免疫防护能力，增加细胞修复能力。依克多因的应用范围越来越广泛。
2、
3、依克多因分子中存在手性碳原子，通过化学合成不容易实现大规模生产。许多耐盐或嗜盐细菌、古菌、放线菌以及真菌等天然宿主菌中发现了依克多因生物合成途径，它们均可以生物合成依克多因，从而在胞内积累依克多因。目前多采用生物合成的方法制备依克多因，主要是通过对能够合成依克多因的野生菌株进行发酵培养后分离提取获得依克多因。通过野生菌进行依克多因发酵水平都不高，依克多因的产量大多都低于10g/l，天然宿主菌积聚依克多因能力有限，而且需要高盐的环境进行发酵培养，生产成本高，无法满足工业生产需要，远远达不到工业化生产依克多因的要求。
4、研究人员积极开展依克多因高效积累研究，基于基因工程和系统代谢工程(涉及基因整合或基因敲除
5、不同微生物体内依克多因的生物合成途径主要是由ectabc基因簇控制。现有技术对依克多因生物合成中的三个关键蛋白ecta、ectb、ectc进行了功能研究，各蛋白的催化机理已经有了比较清楚的研究，这为依克多因的生物合成奠定了基础。现有技术通过在大肠杆菌et08中引入ectabc基因簇，并消除涉及赖氨酸和丙酮酸的途径，优化ecta、ectb和ectc基因的拷贝数，优化培养基和在发酵过程中添加硫酸铵氨基供体后，依克多因产量达到53.2g/l。以上在大肠杆菌中生物合成依克多因的研究表明，大肠杆菌是依克多因生物合成理想的底盘细胞。
6、谷氨酸棒杆菌已经作为许多合成生物材料的底盘细胞，已经通过合成生物学技术在谷氨酸棒杆菌中合成了许多种生物材料。谷氨酸棒杆菌可以大量积累谷氨酸，这正是生物合成依克多因所必须的前体物质。现有技术采用转录平衡的策略在谷氨酸棒杆菌中构建来自斯氏假单胞菌依克多因合成途径。在ectabc基因簇的上游区域随机组合了19个合成启动子和3个单顺反子连接元件，构建包含有185193个突变体的表达文库，筛选到的突变体菌株依克多因产量达到65.0g/l，比原始菌株提高了近5倍，这是在低盐条件下制备依克多因的最高水平。以上在谷氨酸棒杆菌中生物合成依克多因的研究表明，谷氨酸棒杆菌也是依克多因生物合成理想的底盘细胞。
7、虽然在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中依克多因的生物合成已经达到了一定的水平，但是离依克多因的大规模工业化生产还有一定的距离。虽然现有技术利用生物合成技术制备依克多因研究获得了巨大进展，但是许多研究报道中关于依克多因的代谢途径研究并不完整。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术采用以下的研究思路，在大肠杆菌中重构完整的依克多因代谢途径(图1)，依克多因的生物合成水平可能会得到进一步的提升：
2、(1)打通依克多因生物合成的主链代谢途径。利用合成生物学构建相关代谢通路模块，增加磷酸烯醇式丙酮酸(pep)(-丙酮酸)-草酰乙酸-天冬氨酸-磷酸化天冬氨酸-l-天冬氨酸-β-半醛(asa)-l-2,4-二氨基丁酸(daba)-n-γ-乙酰二氨基丁酸-依克多因的代谢流量，同时加强富马酸-天冬氨酸途径代谢，从而加速依克多因的生物合成代谢积累。
3、(2)通过代谢工程技术构建谷氨酸的生物合成途径，增加依克多因生物合成途径中另外一个重要中间体——谷氨酸的积累，增加谷氨酸的积累，从而加速依克多因的生物合成代谢积累。
4、(3)同时我们也可以考虑减少依克多因生物合成的侧链代谢途径，通过基因工程技术敲除部分氨基酸合成代谢通路，如赖氨酸、高丝氨酸等，以减少代谢通路中重要代谢中间体l-天冬氨酸-β-半醛(asa)的流量损耗，从而增加依克多因生物合成代谢积累。
5、本专利技术是通过如下技术方案实现的：
6、本专利技术利用代谢工程和合成生物学技术，用大肠杆菌e.coli bl21(de3)做为底盘表达细胞，表达了嗜盐菌来源的依克多因合成基因簇ectabc，实现依克多因的异源生物合成；并通过双质粒表达系统，在依克多因原始菌中加强表达了大肠杆菌来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc、天冬氨酸氨基转移酶基因aspc、天冬氨酸激酶基因ask、天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd、谷氨酸脱氢酶基因gdha、丙酮酸激酶基因pk、天冬氨酸酶基因aspa和谷氨酸棒杆菌来源的丙酮酸羧化酶基因基因pyc，最终获得了能够高效生物合成依克多因的重组大肠杆菌。
7、作为本专利技术的第一个方面，本专利技术提供一种高效生产依克多因的大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌表达了嗜盐菌来源的依克多因合成基因簇ectabc，其中ectb、ecta、ectc(序列表seq id no.1-3所示序列)基因分别编码2-氨基丁酸转氨酶、2-氨基丁酸乙酰转移酶和依克多因合成酶，所述基因工程菌还表达了(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)八个基因中的任一一种或几种，其中：
8、(a)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc来源于大肠杆菌(序列表seq id no.4所示序列)；
9、(b)天冬氨酸氨基转移酶基因aspc来源于大肠杆菌(序列表seq id no.5所示序列)；
10、(c)天冬氨酸激酶基因ask来源于大肠杆菌(序列表seq id no.6所示序列)；
11、(d)天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd来源于大肠杆菌(序列表seq id no.7所示序列)；
12、(e)丙酮酸羧化酶基因基因pyc来源于谷氨酸棒杆菌(序列表seq id no.8所示序列)；
13、(f)谷氨酸脱氢酶基因gdha来源于大肠杆菌(序列表seq id no.9所示序列)；
14、(g)丙酮酸激酶基因pk来源于大肠杆菌(序列表seq id no.10所示序列)；
15、(h)天冬氨酸酶基因aspa来源于大肠杆菌(序列表seq id no.11所示序列)。
16、在一种实施方式中，所述基因工程菌同时表达了(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)八个基因。
17、在一种实施方式中，所述大肠杆菌基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效生产依克多因的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了嗜盐菌来源的依克多因合成基因簇ectABC，其中ectB、ectA、ectC基因分别编码2-氨基丁酸转氨酶、2-氨基丁酸乙酰转移酶和依克多因合成酶，所述基因工程菌同时表达了(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)八个基因的任一一种或几种，其中：
2.如权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌有三质粒表达系统，所述质粒为pET24a(+)、pACYCDuet-1和pCDFDuet-1。
3.如权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，依克多因生物合成基因簇ectABC在pET24a(+)质粒中表达，ppc、aspC、ask、asd基因在pACYCDuet-1质粒中表达，pyc、gdhA、pk、aspA基因在pCDFDuet-1质粒中表达。
4.如权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，通过T7启动子和lac操纵子分别调控ectA、ectB、ectC、ppc、aspC、ask、asd、pyc、gdhA、pk、asp
5.如权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主为E.coliBL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。
6.如权利要求1-4任一项所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
7.一种利用权利要求1-4任一项所述大肠杆菌基因工程菌发酵生产依克多因的方法，所述方法为：将所述大肠杆菌工程菌在连续补料发酵培养基中发酵培养96h。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养包括如下步骤：
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，用于步骤(1)种子培养的培养基成分为1-10g/L蛋白胨，1-5g/L酵母提取物，1-10g/L氯化钠；用于步骤(2)发酵培养的培养基为2-10g/L葡萄糖，4-20g/L(NH4)2SO4，2-10g/L酵母浸粉，4-20g/L玉米浆，0.4-2g/L K2HPO4，0.4-2g/L KH2PO4，0.2-1g/LMgSO4.7H2O，0.04-0.02g/L FeSO4.7H2O，0.004-0.02g/L MnSO4.H2O。
10.如权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌基因工程菌在生产含依克多因的食品、药品、保健品或化妆品方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高效生产依克多因的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了嗜盐菌来源的依克多因合成基因簇ectabc，其中ectb、ecta、ectc基因分别编码2-氨基丁酸转氨酶、2-氨基丁酸乙酰转移酶和依克多因合成酶，所述基因工程菌同时表达了(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)八个基因的任一一种或几种，其中：
2.如权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌有三质粒表达系统，所述质粒为pet24a(+)、pacycduet-1和pcdfduet-1。
3.如权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，依克多因生物合成基因簇ectabc在pet24a(+)质粒中表达，ppc、aspc、ask、asd基因在pacycduet-1质粒中表达，pyc、gdha、pk、aspa基因在pcdfduet-1质粒中表达。
4.如权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，通过t7启动子和lac操纵子分别调控ecta、ectb、ectc、ppc、aspc、ask、asd、pyc、gdha、pk、aspa基因的表达；lac操纵子和基因序列之间有rbs序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐顺清，储消和，陈万河，叶开，沈建，熊莉，范俊颖，
申请(专利权)人：浙江绿创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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