【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疾病早期检测，特别涉及一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血mirna标志物。
技术介绍
1、肺癌是全世界范围内肿瘤死亡的首要原因，2016年中国癌症中心发布的统计显示，在429万新发癌症病人群中，肺癌是73.3万；在280万的癌症死亡人数中，肺癌占据了其中的61万，是我国名副其实的“第一癌症”。其中，非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。因为肺癌早期症状不明显，75％的肺癌患者就诊时已有局部浸润和远处转移，失去了手术治疗的机会，而目前的治疗手段对肺癌总生存率的提高效果不大，ii-iv期肺癌患者5年生存率大约在40％-5％之间，而i期患者5年生存率可高达92％。因此，加强对高危人群的筛查，提高早诊、早治率是减少肺癌死亡率的最有效方法。
2、x胸片和痰涂片是肺癌筛查最常规的技术，但其敏感性太低；纤支镜刷检或活检能直接窥视病灶，能病理定性，但有创，难以在大样本人群中推广；低剂量螺旋ct是目前被认为最有效的肺癌筛查技术，无创、敏感性高，然而有高达96.4％的假阳性率，而且筛查的成本比较高。因此需要开发新的微创、经济、敏感性和特异性均比较高的早期筛查的技术。
3、微小核酸(microrna，mirna)是近年来发现的一类长度为19-25个核苷酸的非编码小分子rna。它主要通过与靶标基因3'utr的完全或不完全配对，降解靶标基因mrna或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着类似于致癌基因或抑癌基因的功能
4、许多研究报道了mirna在肺癌中的异常表达，尽管现有的研究发现了许多非常有前景的肺癌早期诊断血清mirna，但由于检测对象包含组织、血清、血浆等，检测方法包含测序法、扩增法、杂交法等，研究中入组样本的选取不严格；各种因素缺乏一致性，导致非小细胞肺癌的mirna标志物没有统一的定论，这些结果并不一致，并且不能相互验证，最终能用于肺癌筛查的血清mirna生物标志物以及生物标志物组合标志物还未见定论。
5、其中最关键的原因有以下两点：
6、1、病例和对照样本的选取、收集、保存过程中出现偏差。样本的类别不同，必然会对生物标志物的研发、验证带来不确定性。外周血中变化的mirna主要是由肺癌相关细胞分泌到细胞外的，其组成成分与细胞内或者全血样本中必然不同，同时也会受到其他因素的影响，例如是否经过治疗等。大多数mirna是稳定的存在于健康人群以及癌症人群的外周血中的，并由身体各种组织细胞分泌，各类环境、遗传等非癌症因素，均会影响其表达量。为了排除影响，需要选取大量的人群样本作为研发、验证，以确定生物标志物的真实性。同时，已有研究证明，通过使用不同方法分离、储存的外周血样本，其生物标志物含量也会有所不同。通过癌症组织细胞找到的生物标志物、通过对比晚期癌症找到的生物标志物、通过对比使用不同方法分离、保存的样本找到的生物标志物以及没有经过大量样本研发、验证过的生物标志物，都可能是假阳性的结果，不一定能经得起大规模实验的验证。
7、2、由于分子量很小，导致了mirna在检测上存在一定的难度。尤其在低含量的外周血中，如何稳定、灵敏的检测mirna一直是一个难题。现有一些高通量芯片、测序以及高通量rt-pcr筛选方法的局限性包括稳定性差、重复性差以及低灵敏度等，结合使用少量样本，在研发阶段容易导致产生假阴性结果，忽略重要的mirna生物标志物。同时，技术的不稳定性，也增加了生物标志物在独立样本中验证的不确定性，容易增加结果假阳性、假阴性的概率。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血mirna标志物，基于大量样本验证，明确5个适用于亚洲人群和白种人群非小细胞肺癌的特异性诊断标志物，相对国际上报道的其它mirna标志物，具备有更高的人群特异性；这5个mirna诊断标志物均为首次提出，相较于其他mirna分子标志物更可靠。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血mirna标志物，所述外周血mirna标志物包括hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p中至少一种。
4、所述外周血mirna标志物进一步包括hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p中的一种或两种。
5、一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血mirna标志物，所述外周血mirna标志物包括hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p、hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p中至少一种。在一种实施方式中，所述外周血mirna标志物为hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p、hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p中的二种的组合。在一种实施方式中，所述外周血mirna标志物为hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p、hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p中的三种的组合。在另一种实施方式中，所述外周血mirna标志物为hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p、hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p中的四种的组合。在另一种实施方式中，所述外周血mirna标志物为hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p、hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p中的五种的组合。
6、所述外周血为血清或血浆。
7、所述外周血mirna标志物在诊断为非小细胞肺癌患者的外周血中的表达与在对照样本中的表达相比被差异地调节。hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p三个在癌症患者中被上调，hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p两个在癌症患者中被下调。
8、所述对照样本是未患非小细胞肺癌的受试者。
9、所述非小细胞肺癌包括鳞状细胞肺癌、腺癌肺癌。
10、一种用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测所述的外周血mirna标志物的至少一种试剂。试剂盒用于检测外周血样本中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，其特征在于：包括hsa-miR-1291、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-375、hsa-let-7a-5p中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述外周血miRNA标志物为hsa-miR-1291、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-375、hsa-let-7a-5p中的二种的组合；或
3.根据权利要求1至2中任一项所述的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述外周血为血清或血浆。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述外周血miRNA标志物在诊断为非小细胞肺癌患者的外周血中的表达与在对照样本中的表达相比被差异地调节；进一步优选的，所述外周血miRNA标志物hsa-miR-1291、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-214-3p在癌症患者中被上调，外周血miRNA标志物hsa-miR-375、hsa-let-7a-5p在癌症患者中被
5.根据权利要求4所述的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述对照样本是未患非小细胞肺癌的受试者。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述非小细胞肺癌包括鳞状细胞肺癌、腺癌肺癌。
7.一种用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含用于检测权利要求1至5中任一项所述的外周血miRNA标志物的至少一种试剂；进一步优选的，所述试剂盒用于检测外周血样本中的至少一种选自hsa-miR-1291、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-375和hsa-let-7a-5p的miRNA的表达水平。
8.一种如权利要求1至5中任一项所述的外周血miRNA标志物在制备通过如下方法预测所述受试者发展或具有非小细胞肺癌可能性的非小细胞肺癌诊断试剂中的用途，其特征在于，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：miRNA的表达水平的分数是使用选自由以下各项组成的组的分类算法计算的：支持向量机算法、逻辑回归算法、多项逻辑回归算法、费舍尔氏线性判别算法、二次分类器算法、感知器算法、k-最近邻算法、人工神经网络算法、随机森林算法、决策树算法、朴素贝叶斯算法、自适应贝叶斯网络算法、以及组合了多种学习算法的集成学习方法。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：使用对照的表达水平预训练所述分类算法；进一步优选的，所述对照是选自未患非小细胞肺癌对照和非小细胞肺癌患者组成的组的至少一种。
11.根据权利要求9至10中任一项所述的用途，其特征在于：其中所述分类算法比较所述受试者的表达水平与所述对照的表达水平并且返回数学分数，所述数学分数鉴定所述受试者属于对照组中的任一个的可能性。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的用途，其特征在于：其中所述miRNA的表达水平是浓度、log(浓度)、Ct/Cq数、2的Ct/Cq数次方中的任一种。
13.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述非小细胞肺癌包括各阶段非小细胞肺癌；进一步优选的，所述受试者包括且不限于亚洲人、白种人。
...【技术特征摘要】
1.一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血mirna标志物，其特征在于：包括hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p、hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的外周血mirna标志物，其特征在于：所述外周血mirna标志物为hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p、hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p中的二种的组合；或
3.根据权利要求1至2中任一项所述的外周血mirna标志物，其特征在于：所述外周血为血清或血浆。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的外周血mirna标志物，其特征在于：所述外周血mirna标志物在诊断为非小细胞肺癌患者的外周血中的表达与在对照样本中的表达相比被差异地调节；进一步优选的，所述外周血mirna标志物hsa-mir-1291、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-214-3p在癌症患者中被上调，外周血mirna标志物hsa-mir-375、hsa-let-7a-5p在癌症患者中被下调。
5.根据权利要求4所述的外周血mirna标志物，其特征在于：所述对照样本是未患非小细胞肺癌的受试者。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的外周血mirna标志物，其特征在于：所述非小细胞肺癌包括鳞状细胞肺癌、腺癌肺癌。
7.一种用于诊断非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含用于检测权利要求1至5中任一项所述的外周血mirna标志物的至少一种试剂；进一步优选的，所述试剂盒用于检测外周血样...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹瑞阳，苏丹，程赫，应莉莎，周砺寒，
申请(专利权)人：觅瑞杭州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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