【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种优化组合突变改造的热稳定性枯草芽孢杆菌脂肪酶a，属于酶工程。
技术介绍
1、枯草芽孢杆菌脂肪酶a能够促进脂肪的水解反应，将复杂的脂肪分子分解成甘油和脂肪酸，确保了生物体内脂肪的有效消化和吸收，为能量利用提供了高效途径。同时，脂肪酶a对脂类相关底物具有高度特异性催化，避免了对其他生物分子的干扰；此外，脂肪酶a在温和的环境条件下展现出高活性和高周转数，使得它成为高效催化反应的候选酶。在高效和环保的工业生产趋势下，脂肪酶a作为一种具备生物降解性的催化剂具有广阔的应用前景。在工业应用中，酶制剂通常需要在较为苛刻的环境下使用，以满足生产过程的要求。
2、然而，天然脂肪酶a的热稳定性较低。通过增强脂肪酶a的热稳定性，我们能够在更广泛的温度范围内应用该生物催化剂，从而实现许多关键领域的创新和进步：(1)在食品加工方面，热稳定的脂肪酶a可以提高食品品质和加工效率，改善产品质地和口感；(2)在洗涤剂制造领域，热稳定的脂肪酶a能够在高温条件下持续催化反应，提高洗涤效果和生产效率；(3)在生物燃料生产中，热稳定的脂肪酶a可以在高温条件下进行连续催化反应，提高生物燃料的产量和质量。
3、目前，研究人员致力于提高脂肪酶a的热稳定性，例如蛋白工程技术通过对酶的基因进行改造，引入特定的突变或修饰，以增强其在高温条件下的稳定性；亲和层析技术则通过与特定配体结合，选择性地捕获和纯化具有更高热稳定性的酶变体；化学修饰技术可以改变酶分子的物理和化学性质，增强其热稳定性。(1)定向进化策略模拟自然选择的原理，结合基因突变和筛选
4、此外，由于单点突变的贡献通常相对较小，因此需要多个单点突变累积才能获得显著的稳定性提高。pross(protein repair one stop shop)是一种结合基于序列保守性的位置特异性矩阵以及基于结构能量函数的结构自由能差打分的在线设计平台，可以直接给出包含高真阳性率单点的组合突变体。但是，当蛋白质中的几个残基被取代时，组合突变体的热稳定性提高并不是每个残基独立贡献的累加；并且通常以催化活性丢失作为补偿。公开号为cn 111073876a的中国专利技术专利中指出，将枯草芽孢杆菌脂肪酶a进行突变后得到的六位点突变体(f17a/v74i/l114p/i135v/m137a/i157l)的解折叠温度tm升高了7.43℃，t50由51.2℃升高为59.6℃，升高了8.4℃，但是，酶活只有亲本酶的44.8％，可见，通过多个位点叠加提高热稳定性，导致酶活损失严重。其中，得到的四位点突变体(f17a/l114p/m137a/i157l)的解折叠温度tm升高了7.30℃，t50由51.2℃升高为57.1℃，升高了5.9℃，酶活为亲本酶的99.7％。较少位点的叠加，热稳定性提高程度与六位点突变体相当，酶活损失少。
5、可见，热稳定性改造会导致酶活有一定的损失，如何能得到高热稳定性突变体酶，同时能减少酶活丢失问题，并且提高突变的组合效率，是研究的难点和热点。
技术实现思路
1、技术问题：本专利技术要解决的是在枯草芽孢杆菌脂肪酶a热稳定性改造中，突变导致的(或避免)酶活丢失问题，提高突变的组合效率。
2、本专利技术提供了热稳定性大幅提高的四位点(m8f/a15s/f17s/i157m，其tm为56.91℃)和五位点(m8f/a15s/f17s/g155s/i157m，其tm为59.29℃)的脂肪酶a组合突变体，相较于wt(tm为46.4℃)，组合突变体的tm分别提高了10.51℃和12.89℃，且单点突变的tm的平均贡献分别约为2.62℃和2.57℃。
3、本专利技术还提供了一种突变筛选策略，可以有效的用于高效组合突变体的构建，且催化活性得到较好的保持(相对酶活性分别约为118％和92％)；且新的组合突变体(四位点的组合突变体和五位点的组合突变体)相较于pross策略获得的复合突变体(13个突变位点，其tm提高了13.6℃，相对酶活性约为106％)表现出更高效的组合叠加效率(单点突变的平均贡献分别约为1.1℃)。
4、本专利技术的技术方案如下：
5、本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体，所述突变体是以氨基酸序列如seq id no.1所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶a为亲本酶进行突变后得到的四位点突变体m8f/a15s/f17s/i157m，其氨基酸序列如seq id no.2所示；将氨基酸序列如seq id no.1所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶a的第8位的甲硫氨酸突变为苯丙氨酸，将第15位的丙氨酸突变为丝氨酸，将第17位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，同时将157位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸得到的。
6、本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体，所述突变体是以氨基酸序列如seq id no.1所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶a为亲本酶进行突变后得到的五位点突变体m8f/a15s/f17s/g155s/i157m，其氨基酸序列如seq id no.3所示；所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶a的第8位的甲硫氨酸突变为苯丙氨酸，将第15位的丙氨酸突变为丝氨酸，将第17位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，将第155位的甘氨酸突变为丝氨酸，将第157位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸得到的。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶a亲本酶的核苷酸序列如seq id no.4所示。
8、本专利技术还提供了编码上述枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体的基因。
9、本专利技术还提供了含有上述基因的重组载体。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体是以pet系列质粒为表达载体。
11、本专利技术还提供了表达上述枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体或携带上述基因或携带上述重组载体的基因工程菌。
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1.一种枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A的第8位的甲硫氨酸突变为苯丙氨酸，第15位的丙氨酸突变为丝氨酸，第17位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，同时将157位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸得到的；
2.编码权利要求1所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pET系列质粒为表达载体。
5.表达权利要求1所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体或携带权利要求2所述基因或携带权利要求3或4所述重组载体的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以细菌或真菌为表达宿主。
7.一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A的第8位的甲硫氨酸突变为苯丙氨酸，将第15位的丙氨酸突变为丝氨酸，将第17位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，同时将157位的异亮氨酸
8.一种生产枯草芽孢杆菌脂肪酶A的方法，其特征在于，所述方法为，以权利要求5或6所述的基因工程菌为生产菌株，发酵生产枯草芽孢杆菌脂肪酶A。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌为，以Escherichia coliBL21(DE3)为表达宿主，表达了权利要求1所述的突变体。
10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体在食品、化工品或药品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如seqid no.1所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶a的第8位的甲硫氨酸突变为苯丙氨酸，第15位的丙氨酸突变为丝氨酸，第17位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，同时将157位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸得到的；
2.编码权利要求1所述枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pet系列质粒为表达载体。
5.表达权利要求1所述枯草芽孢杆菌脂肪酶a突变体或携带权利要求2所述基因或携带权利要求3或4所述重组载体的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以细菌或真菌为...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕成，丁健，方瑞杰，蒋伦，田书恒，李天乙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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