【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种丙二酰辅酶a代谢途径高可塑性的酵母底盘细胞的构建方法。
技术介绍
1、中心碳代谢是所有生命体的关键代谢途径，合成胞内各种前体化合物、能量及辅因子，是细胞内代谢流量的调控中枢。工程化改造中心碳代谢，以调控细胞内代谢流量的分配，是构建高效微生物细胞工厂的关键需求之一。由于中心碳代谢涉及基因数量多，且调控具有鲁棒性和复杂性等特征，通常需要对其进行大量的基因修饰和反复测试，以获得高效的细胞工厂。遗憾的是，目前仍缺乏可实现对中心碳代谢途径多基因、多层次的快速高效的组合改造体系，大大限制了高效微生物细胞工厂的构建效率。因此，开发快速、高效的中心碳代谢途径高通量组合改造技术，是构建高效微生物细胞工厂亟待突破的瓶颈之一。
2、近年来，多种中心碳代谢途径工程化改造技术/策略相继被报道。在dna和rna水平上，基因调节元件(例如启动子、核糖体结合位点、终止子)工程化改造技术、rnai和srna技术、动态调控策略及基于crispr系统的衍生技术(如(d)cas9、crispra、crispri)已被成功应用于中心碳代谢途径的改造。在蛋白水平上，通过蛋白质标签工程能够实现蛋白酶浓度、空间分布的控制；而酶工程技术(如蛋白酶突变、异源替换、融合表达等)能够对蛋白酶活性进行调控。虽然通过以上单一水平的调控，能够在一定程度上提高目标产物产量，但仍难以满足构建高效微生物细胞工厂的需求。为了进一步提高中心碳代谢途径的改造效率，开发多基因、多层次的组合改造技术是该领域的研究热点之一。crispr系统是当前最新的多基因编辑技术，
技术实现思路
1、基于以上技术问题，本专利技术提供一种丙二酰辅酶a代谢途径高可塑性的酵母底盘细胞的构建方法，可突破天然细胞的局限，为细胞中心碳代谢途径的高效组合改造提供新的方法体系，同时对进一步提升微生物细胞工厂的构建效率和强化工程化细胞的工作效能产生重要的促进作用。
2、本专利技术提供一种丙二酰辅酶a代谢途径高可塑性的酵母底盘细胞的构建方法，包括以下步骤：
3、将酵母中丙二酰辅酶a代谢途径的功能冗余基因删除，在质粒上重建主要功能基因的编码基因簇，然后将主要功能基因从基因组原位点删除，得到人工酵母细胞；
4、将酵母中丙二酰辅酶a代谢途径相关蛋白酶编码的主要功能基因分别构建至含有bsmbi位点的组装型质粒上，得到含有主要功能基因的不同大质粒；
5、将不同大质粒混合后连同靶向整合位点的grna质粒共转化至所述人工酵母细胞，转化产物经过孵育，得到改造后的酵母底盘细胞。
6、优选地，所述酵母为酿酒酵母。
7、优选的，所述质粒为prs416质粒。
8、优选地，删除冗余基因及主要功能基因是利用crispr-cas9基因编辑系统进行。
9、优选地，所述冗余基因为pdc5、pdc6、acs1、hxk1、ald6、tdh1、tdh2、pyk2、fbp1、glk1及eno1。
10、优选地，所述主要功能基因为pgi1、acs2、gpm1、cdc19、hxk2、pfk2、pgk1、pdc1、tdh3、eno2、fba1、pfk1、tpi1及acc1。
11、优选地，5个不同的大质粒分别包括5个不同的dna大片段，5个不同的dna大片段分别为chrix-hl-pgi1-acs2-gpm1-pcdc19、cdc19-hxk2-pfk2-ppgk1、pgk1-pdc1-tdh3-peno2、eno2-fba1-pfk1-tpi1和ttpi1-acc1-leu2-hr-chrix；
12、其中，chrix-hl是酵母九号染色体上游同源臂，hr-chrix是酵母九号染色体下游同源臂，pcdc19是cdc19的启动子序列，ttpi1是tpi1的终止子序列，pgi1、acs2、gpm1、cdc19、hxk2、pfk2、pgk1、pdc1、tdh3、eno2、fba1、pfk1、tpi1及acc1是不同基因对应的dna片段。
13、优选地，不同大质粒是按照等摩尔比进行混合。
14、优选地，所述孵育是先将转化产物涂布于sd-leu培养基后，30℃孵育2～3d，获得转化子；再通过平板影印将转化子原位转移至sd-leu+5foa固体培养基上，30℃孵育2～4d。
15、本专利技术还提供一种根据上述方法构建得到的丙二酰辅酶a代谢途径高可塑性的人工酵母底盘细胞。
16、对比现有技术，本专利技术的有益效果为：
17、(1)本专利技术通过构建人工酵母底盘细胞，实现丙二酰辅酶a(malonyl-coa)代谢途径快速、高效及高通量的组合改造。
18、(2)本专利技术提供的方法，能够对malonyl-coa代谢途径进行快速的工程化组合改造，突破了目前多基因改造效率低下的限制，大大提高了细胞内代谢途径的改造效率，并突破了天然细胞的局限和现有技术的壁垒。
19、(3)本专利技术提供的方法，可应用于以malonyl-coa为前体物的酵母细胞工厂的高效构建。
20、(4)本专利技术提供的方法，可应用于以malonyl-coa代谢途径中间产物为前体物的酵母细胞工厂的高效构建。
21、(5)本专利技术提供的方法，不仅仅限制于malonyl-coa代谢途径，可以应用于细胞内其他代谢途径的高通量组合改造。
22、(6)本专利技术提供的方法，对必须或主要功能基因的致死突变和适宜工程化改造位点进行扫描，对基因序列和功能之间的映射关系进行研究。
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1.一种丙二酰辅酶A代谢途径高可塑性的酵母底盘细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述质粒为PRS416质粒。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述冗余基因为PDC5、PDC6、ACS1、HXK1、ALD6、TDH1、TDH2、PYK2、FBP1、GLK1及ENO1。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述主要功能基因为PGI1、ACS2、GPM1、CDC19、HXK2、PFK2、PGK1、PDC1、TDH3、ENO2、FBA1、PFK1、TPI1及ACC1。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，不同大质粒分别包括5个不同的DNA大片段，5个不同的DNA大片段分别为ChrIX-HL-PGI1-ACS2-GPM1-PCDC19、CDC19-HXK2-PFK2-PPGK1、PGK1-PDC1-TDH3-PENO2、ENO2-FBA1-PFK1-TPI1和TTPI1-AC
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，不同大质粒是按照等摩尔比进行混合。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述孵育是先将转化产物涂布于SD-LEU培养基，28～35℃孵育2～3d，获得转化子；再通过平板影印将转化子原位转移至SD-LEU+5FOA固体培养基上，28～35℃孵育2～3d。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，删除冗余基因及主要功能基因是利用CRISPR-Cas9基因编辑系统进行。
10.一种根据权利要求1～9任一项所述方法构建得到的丙二酰辅酶A代谢途径高可塑性的人工酵母底盘细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种丙二酰辅酶a代谢途径高可塑性的酵母底盘细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述质粒为prs416质粒。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述冗余基因为pdc5、pdc6、acs1、hxk1、ald6、tdh1、tdh2、pyk2、fbp1、glk1及eno1。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述主要功能基因为pgi1、acs2、gpm1、cdc19、hxk2、pfk2、pgk1、pdc1、tdh3、eno2、fba1、pfk1、tpi1及acc1。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，不同大质粒分别包括5个不同的dna大片段，5个不同的dna大片段分别为chrix-h...
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