【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子的制备方法，其可作为检测探针被应用于b型单胺氧化酶活性检测。
技术介绍
1、b型单胺氧化酶是一种可以氧化多种胺类生物递质的高活性酶，其在维持机体的正常生理状态中发挥重要作用。众多研究表明b型单胺氧化酶是神经退行性疾病（阿尔兹海默症、帕金森病）及肝硬化（肝细胞癌）的生物标志物，同时在多种疾病的发生发展中都发挥了重要作用。临床上已以b型单胺氧化酶的活性情况作为组织纤维化的评价指标，上述研究表明该酶活性的高效灵敏检测对相关疾病的诊断和治疗有着重大应用价值。
2、目前，对b型单胺氧化酶的活性检测研究大多基于紫外法、荧光法、色谱法及放射性标记法，色谱法存在结果不直观，操作较复杂的问题；放射性标记法具有放射性，对于操作人员会产生一定的毒副作用；而单独使用紫外法或荧光法则存在较高的假阳性问题。因此，设计出一种多重信号共同响应、简便、快捷、直观的b型单胺氧化酶活性检测方法是有必要且迫切的。
3、银纳米粒子在抗病毒、抗真菌、给药系统等领域有着广泛应用，因其小尺寸、生物惰性而被用于生物医学环境的检测中。近年来针对于银纳米粒子的研究也证实多种分子都可作为银纳米粒子合成的封端剂和保护剂，而粒子的尺寸、形状、封端剂及封端剂所处环境等特征的改变都将显著改变其光学特性，检测分子引起的粒子形貌及所处环境状态的改变将产生相应信号响应，从而对应于检测分子的含量或活性数据。综上所述，银纳米粒子的独特性质，使其在构建b型单胺氧化酶活性检测方法中具有极大的应用潜力。
技术实现
1、本专利技术的目的是提供一种聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子的制备方法，并将其应用于b型单胺氧化酶的活性检测中，并可用于在血清中检测b型单胺氧化酶活性。
2、本专利技术提供了一种聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子，其制备方法如下：
3、将聚乙烯亚胺溶液、硝酸银溶液和氢氧化钠溶液依次加入离心管，在60~100℃下搅拌(200~800 rpm)反应10~60分钟后，调节ph至7.0~9.0，用0.22 μm滤膜过滤，即得聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针。
4、聚乙烯亚胺，分子量为600~70000，硝酸银溶液浓度为5~15 mm，聚乙烯亚胺溶液浓度为2~10%，氢氧化钠溶液浓度为0.5~1.2 m, 且聚乙烯亚胺溶液、硝酸银溶液、氢氧化钠溶液和去离子水的体积比为5:5:2:8。
5、所述的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子可作为探针应用于b型单胺氧化酶的活性检测。所述的b型单胺氧化酶活性检测的方法为：以聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子作为探针，同b型单胺氧化酶氧化苯乙胺获得的产物苯乙醛结合，聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子从淡黄色、澄清、弱荧光溶液转变为亮黄色、浑浊、强荧光溶液，产生紫外、荧光和散射信号的改变，测定紫外、荧光和散射信号强度，从而获得b型单胺氧化酶活性强度。
6、下面进一步对b型单胺氧化酶活性检测方法、选择性及抗干扰能力的评估、检测稳定性的评估以及在血清检测中的应用实验步骤作进一步详细说明。
7、1、聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针进行b型单胺氧化酶活性检测方法
8、所述的方法为用ph值为7.0~8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液稀释待测b型单胺氧化酶样品，25~40℃恒温预热后，加入5~15 mm苯乙胺溶液反应，反应后加入聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子进一步反应，反应完全后检测其荧光、紫外及散射信号强度，进而获得b型单胺氧化酶活性情况。
9、所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液浓度为10~40 mm，加入苯乙胺后的酶反应温度为25~40℃，加入聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子的量为终溶液体积的10%~40%，加入聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子后的反应温度为30~70℃。信号强度用紫外分光光度计及荧光分光光度计进行检测。针对于紫外信号，选取405 nm处的吸光度值；针对于荧光信号，选取308nm激发光下，386 nm处的荧光强度值；针对于共振瑞利散射信号，选取467 nm处的共振瑞利散射峰强度值。
10、2、评估聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针检测b型单胺氧化酶的选择性和抗干扰能力
11、所述的检测方法可选择性检测b型单胺氧化酶，并能够在干扰酶的存在下获得b型单胺氧化酶的活性情况。具体实验步骤如下：针对于选择性能力考察实验，取不同酶以“聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针进行b型单胺氧化酶活性检测方法”中所述方法进行反应；针对于抗干扰能力考察实验，在b型单胺氧化酶的酶反应过程中，将5%~15%的其它酶引入反应体系中，其它步骤同“聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针b型单胺氧化酶活性检测方法”中所述方法保持一致。
12、图1为紫外(a)、荧光b)、散射(c)信号下，聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子选择性响应b型单胺氧化酶的选择性能力评估情况，图2为紫外(a)、荧光(b)、散射(c)信号下，聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子在其它酶存在的干扰下，响应b型单胺氧化酶的抗干扰能力评估情况。图中酶种类从左至右分别为b型单胺氧化酶、 α-葡萄糖苷酶、 β-半乳糖苷酶、牛血清白蛋白、 β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶。
13、3、聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针对b型单胺氧化酶活性检测的稳定性
14、检测信号及时间稳定性是活性检测探针性能的重要指标，对所述的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针进行稳定性检测，具体方法如下：针对于检测信号稳定性，在0~90 min内对反应后体系在405 nm处的吸光度值进行检测；针对于时间稳定性，聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针于10~25℃下避光保存，分别在20天内进行多次检测实验，以405 nm处的吸光度值变化表述聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子检测性能的时间稳定性。
15、图3的结果表明，聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针的检测信号(a)能够在90 min内保持稳定，这使得信号的检测不被时间影响。聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在20天内都能保持良好的b型单胺氧化酶信号响应，即本专利技术中的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在b型单胺氧化酶的检测中具有良好的稳定性能。
16、4、聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在血清中b型单胺氧化酶活性检测的应用
17、血清中含有多种蛋白及小分子物质，多种物质的存在显著干扰了b型单胺氧化酶活性检测方法的应用。本专利技术中聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在血清中b型单胺氧化酶的活性检测中得到了好的应用，具体操作步骤如下：将血清样本用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液稀释，25~40℃恒温预热后，加入5~15 mm苯乙胺溶液反应，反应后加入聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子反应，反应完全后检测其荧光、紫外及散射信号强度，进而获得b型单胺氧化酶活性数据。
18、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液浓度为10~40 mm，加入苯乙胺后的酶反应温度为25~4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针的制备方法，是将聚乙烯亚胺溶液、硝酸银溶液和氢氧化钠溶液依次加入离心管，在60~100 ℃下搅拌反应10~60分钟后，调节pH至7.0~9.0，用0.22 μm滤膜过滤，即得聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针。
2.如权利要求1所述一种聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针的制备方法，其特征在于：硝酸银溶液浓度为5~15 mM，聚乙烯亚胺溶液浓度为2~10%，氢氧化钠溶液浓度为0.5~1.2M，且聚乙烯亚胺溶液、硝酸银溶液、氢氧化钠溶液和去离子水的体积比为5:5:2:8。
3.如权利要求1所述一种聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针的制备方法，其特征在于：搅拌速度为200~800 rpm。
4.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在B型单胺氧化酶活性检测中的应用。
5.如权利要求4所述的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在B型单胺氧化酶活性检测中的应用，其特征在于：将待测B型单胺氧化酶样品溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到待测B型单胺氧化酶样品溶液，25~40℃恒温预热后，加苯乙胺溶液25~40℃反应，
6.如权利要求4所述的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在B型单胺氧化酶活性检测中的应用，其特征在于：将B型单胺氧化酶、α-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、牛血清白蛋白、β-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶分别溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到待测酶样品溶液，25~40℃恒温预热后，加苯乙胺溶液25~40℃反应，反应后加入聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子30~70℃下进一步反应，反应完全后检测其荧光、紫外或散射信号强度，聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子只能使得B型单胺氧化酶产生强烈的荧光、紫外或散射信号强度，实现了B型单胺氧化酶的单一选择性检测。
7.如权利要求5或6所述的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在B型单胺氧化酶活性检测中的应用，其特征在于：4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液浓度为10~40 mM，pH为7.0~8.0；苯乙胺溶液的浓度为5~15 mM；待测酶样品溶液浓度为1 U/mL。
8.如权利要求5或6所述的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在B型单胺氧化酶活性检测中的应用，其特征在于：针对于紫外信号，选取405 nm处的吸光度值；针对于荧光信号，选取308 nm激发光下，386 nm处的荧光强度值；针对于共振瑞利散射信号，选取467 nm处的共振瑞利散射峰强度值。
...【技术特征摘要】
1.一种聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针的制备方法，是将聚乙烯亚胺溶液、硝酸银溶液和氢氧化钠溶液依次加入离心管，在60~100 ℃下搅拌反应10~60分钟后，调节ph至7.0~9.0，用0.22 μm滤膜过滤，即得聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针。
2.如权利要求1所述一种聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针的制备方法，其特征在于：硝酸银溶液浓度为5~15 mm，聚乙烯亚胺溶液浓度为2~10%，氢氧化钠溶液浓度为0.5~1.2m，且聚乙烯亚胺溶液、硝酸银溶液、氢氧化钠溶液和去离子水的体积比为5:5:2:8。
3.如权利要求1所述一种聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针的制备方法，其特征在于：搅拌速度为200~800 rpm。
4.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在b型单胺氧化酶活性检测中的应用。
5.如权利要求4所述的聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子探针在b型单胺氧化酶活性检测中的应用，其特征在于：将待测b型单胺氧化酶样品溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到待测b型单胺氧化酶样品溶液，25~40℃恒温预热后，加苯乙胺溶液25~40℃反应，反应后加入聚乙烯亚胺功能化银纳米粒子30~70℃下进一步反应，反应完全后检测其荧光、紫外、散射信号强度，获得b型单...
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