【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，尤其涉及一种森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒及其应用。
技术介绍
1、森林脑炎病毒（tick borne encephalitis virus, tbev）是虫媒病毒，主要由蜱虫叮咬引起病毒传播，可引发一种森林地区的自然疫源性疾病，即森林脑炎，感染者主要临床症状以中枢神经系统病变为主要特征，严重者甚至可导致死亡，严重危害林区覆盖居民的健康安全。除对人类造成危害之外，森林脑炎病毒对家禽的危害也不可忽视。感染森林脑炎病毒后，一部分家禽会出现神经系统症状，进而影响其寿命。除此之外，森林脑炎病毒感染牛、羊等动物后，其产出的牛奶、羊奶中也会含有少量森林脑炎病毒，人类食用未经消毒的牛奶及羊奶同样也会感染森林脑炎病毒。林区的饲养犬、饲养鹿等也面临森林脑炎病毒感染的威胁。
2、目前针对森林脑炎病毒的检测方法主要为病毒分离培养、血清学方法和分子生物学方法。病毒分离培养对细胞培养技术要求极高，不仅易被外源微生物污染，而且操作复杂、对操作人员和操作环境要求较高、耗时很长；血清学方法检测是一种可用的手段，但抗体出现时间较晚，感染前期容易出现检测不到的情况；且出于早期检测及经济等原因考虑，牲畜的感染情况可由pcr手段进行检测。
3、实时荧光定量pcr（qpcr）通过在pcr过程中引入荧光探针，实时监测扩增反应的进程。这种荧光探针与目标dna序列的特定区域结合，当dna扩增过程中的荧光信号增加时，可以定量测量目标dna的含量。一般可以把qpcr分为dna结合染料法（sybr）和基于探针（taqma
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒，旨在解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒，包括四组引物探针混合液中的任意一组、qpcr反应液、阴性标准品、按梯度稀释的6支阳性标准品和无菌水；所述qpcr反应液包括taq dna聚合酶、dntps、mgcl2、kcl和tris-hcl。
4、进一步的，四组所述引物探针混合液分别为：
5、a组.tbev-ns5-1forward：5’-cgtacaggacctggcagta-3’；
6、tbev-ns5-1reverse：5’-gagccttggtgtcaacctt-3’；
7、tbev-ns5-1探针：5’-fam-tttgaacactcgctgctgtccaa-bhq1-3’；
8、b组.tbev-ns5-2forward：5’-ttggctgaggacaaggt-3’；
9、tbev-ns5-2reverse：5’-tcctgagccttggtgtc-3’；
10、tbev-ns5-2探针：5’-fam-tgaacactcgctgctgtccaaag-bhq1-3’；
11、c组.tbev-ns5-3forward：5’-cgaatggccatgactga-3’；
12、tbev-ns5-3reverse：5’-cctgttctgctcatcag-3’；
13、tbev-ns5-3探针：5’-fam-aggttgacaccaaggctcagga-bhq1-3’；
14、d组.tbev-ns5-4forward：5’-tatggtgagacctggc-3’；
15、tbev-ns5-4reverse：5’-ctttgaacactcgctg-3’；
16、tbev-ns5-4探针：
17、5’-fam-tggccatggaacgcgcgtgagga-bhq1-3’。
18、进一步的，森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒中阳性标准品为从森林脑炎病毒中提取的rna逆转录的cdna经稀释而成的6支不同浓度的森林脑炎病毒cdna；森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒中阴性标准品为胎牛血清提取的rna逆转录而成的cdna。
19、一种如上述所述的森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒在制备检测森林脑炎病毒产品中的应用。
20、进一步的，所述检测森林脑炎病毒产品应用于森林脑炎病毒样本检测、蜱虫样本中森林脑炎病毒检测和森林脑炎病毒感染动物检测。
21、进一步的，所述森林脑炎病毒感染动物包括蜱虫、牛、山羊、狗和鹿。
22、进一步的，所述森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
23、分别以待测样品提取的rna经逆转录制成的cdna、按梯度稀释的6支不同浓度的阳性标准品、阴性标准品为模板，利用森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒配制qpcr反应体系，进行qpcr检测；
24、建立标准曲线：以不同浓度的阳性标准品的浓度对数值为横坐标，qpcr扩增所得相应的ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
25、将待测样本的qpcr扩增所得ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的森林脑炎病毒核酸定量结果。
26、进一步的，所述qpcr检测的反应条件为：95℃预变性5 min；每个循环95℃变性5s，60℃退火延伸30 s，共45个循环。
27、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
28、本专利技术根据森林脑炎病毒远东亚型具有代表性的19种不同的毒株设计出四种引物探针组合，能检测出流行的远东亚型毒株；本专利技术在应用于森林脑炎病毒的检测、蜱虫中森林脑炎病毒的检测及森林脑炎病毒感染动物的早期检测具有实际意义，可利用简单的步骤就能实现检测的目的，灵敏度和准确性较高，且用时较短；本专利技术利用探针法qpcr检测，检出下限可达到100核酸拷贝。
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1.一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒，其特征在于，包括四组引物探针混合液中的任意一组、qPCR反应液、阴性标准品、按梯度稀释的6支阳性标准品和无菌水；所述qPCR反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、KCl和Tris-HCl。
2.根据权利要求1所述的森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒，其特征在于，四组所述引物探针混合液分别为：
3.根据权利要求1所述的森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒，其特征在于，森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒中阳性标准品为从森林脑炎病毒中提取的RNA逆转录的cDNA经稀释而成的6支不同浓度的森林脑炎病毒cDNA；森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒中阴性标准品为胎牛血清提取的RNA逆转录而成的cDNA。
4.一种根据权利要求1-3任一所述的森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒在制备检测森林脑炎病毒产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述检测森林脑炎病毒产品应用于森林脑炎病毒样本检测、蜱虫样本中森林脑炎病毒检测和森林脑炎
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述森林脑炎病毒Taqman-
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述qPCR检测的反应条件为：95℃预变性5min；每个循环95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共45个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒，其特征在于，包括四组引物探针混合液中的任意一组、qpcr反应液、阴性标准品、按梯度稀释的6支阳性标准品和无菌水；所述qpcr反应液包括taq dna聚合酶、dntps、mgcl2、kcl和tris-hcl。
2.根据权利要求1所述的森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒，其特征在于，四组所述引物探针混合液分别为：
3.根据权利要求1所述的森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒，其特征在于，森林脑炎病毒taqman-qpcr检测试剂盒中阳性标准品为从森林脑炎病毒中提取的rna逆转录的cdna经稀释而成的6支不同浓度的森林脑炎病毒cdna；森林...
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