【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请整体涉及使用纳米孔对多核苷酸进行测序。
技术介绍
1、大量的学术和公司时间和能量已被投入到使用纳米孔对多核苷酸进行测序。例如，已经测量了dna与dna聚合酶i的ki enow片段(kf)在施加的电场中的纳米孔顶部的复合物的停留时间。或者，例如，电流或通量测量传感器已经用于涉及在α-溶血素纳米孔中捕获的dna的实验中。或者，例如，当在α-溶血素纳米孔顶部的电场中捕获时，kf-dna复合物已经基于它们的性质进行了区分。在另一个示例中，使用单一聚合酶复合物和溶液中的核苷酸类似物执行多核苷酸测序，该单一聚合酶复合物包括聚合酶和附接在纳米孔近侧的模板核酸。核苷酸类似物包括电荷封闭标记，其与核苷酸类似物的多磷酸部分附接，使得当核苷酸类似物掺入正在合成的多核苷酸中时，电荷封闭标记裂解。通过纳米孔检测电荷封闭标记，以确定所掺入的核苷酸的存在和身份，从而确定模板多核苷酸的序列。在其他示例中，构建体包括跨膜蛋白纳米孔亚单位和核酸处理酶。
2、olasagasti等人，“replication of individual dna molecules underelectronic control using a protein nanopore”，nature nanotechnology，第5卷第11期：第798-806页，2010年，公开了通过纳米孔设置dna模板。dna模板-聚合酶复合物在α-溶血素纳米孔的第一侧上形成，并且包括dna双链体和聚合酶。dna模板包括最初位于α-溶血素纳米孔的第二侧上的无碱基报告核苷酸。当基于dn
3、然而，此类先前已知的组合物、系统和方法可能未必足够稳健、可重复或灵敏，并且可能不具有用于实际实施的足够高的通量，例如，要求商业应用诸如临床中的基因组测序以及要求成本有效且高度准确的操作的其他环境。因此，需要用于对多核苷酸进行测序的改善的组合物、系统和方法。
技术实现思路
1、本文提供了使用纳米孔对多核苷酸进行测序。
2、本文的一些示例提供了一种使用纳米孔对多核苷酸进行测序的方法，该纳米孔包括第一侧、第二侧以及延伸通过该第一侧和该第二侧的孔口。该方法可包括(a)将多核苷酸设置为通过纳米孔的孔口，使得多核苷酸的3'端在纳米孔的第一侧上，并且多核苷酸的5'端在纳米孔的第二侧上。该方法可包括(b)与多核苷酸在纳米孔的第一侧上形成双链体，该双链体包括3'端。该方法可包括(c)通过将第一核苷酸添加到双链体的3'端来在纳米孔的第一侧上延伸双链体。该方法可包括(d)施加第一力，从而将所延伸的双链体的3'端设置在孔口内。该方法可包括，当施加第一力时，使用纳米孔抑制所延伸的双链体的3'端易位至纳米孔的第二侧；以及测量所延伸的双链体的3'端和多核苷酸的单链部分的电特性的值。该方法可包括(e)使用操作(d)中测量的值来识别第一核苷酸。
3、在一些示例中，操作(d)中测量的值包括纳米孔两端的电流、离子电流、电阻或电压降。在一些示例中，操作(d)中测量的值包括纳米孔两端的电流、离子电流、电阻或电压降的噪声。在一些示例中，操作(d)中测量的值包括噪声的标准偏差。
4、在一些示例中，操作(d)中测量的值至少基于多核苷酸的单链部分的m个核苷酸和所延伸的双链体的d对杂交核苷酸。在一些示例中，m大于或等于2，并且d大于或等于1。在一些示例中，m大于或等于3。在一些示例中，d大于或等于2。在一些示例中，单链部分的m个核苷酸中的至少一者包括经修饰的碱基，该方法包括使用操作(d)中测量的值来识别经修饰的碱基。在一些示例中，经修饰的碱基包括甲基化的碱基。
5、在一些示例中，该方法还包括当在操作(d)中施加第一力时抑制将另一个核苷酸添加到所延伸的双链体的3'端。在一些示例中，纳米孔抑制另一个核苷酸的添加。
6、在一些示例中，纳米孔被取向为使得纳米孔的第一侧包括孔口的大部分。在一些示例中，纳米孔被取向为使得纳米孔的第二侧包括孔口的大部分。
7、在一些示例中，该方法还包括(f)施加经修饰的第一力，从而再次将所延伸的双链体的3'端设置在孔口内。该方法还可包括，当施加经修饰的第一力时：使用纳米孔抑制所延伸的双链体的3'端易位至纳米孔的第二侧；以及测量所延伸的双链体的3'端和多核苷酸的单链部分的电特性的值。该方法还可包括(g)使用操作(f)中测量的值来识别第一核苷酸。
8、在一些示例中，使用与双链体的3'端接触的聚合酶添加第一核苷酸。在一些示例中，该方法还可包括可逆地抑制聚合酶将第二核苷酸添加到所延伸的双链体的3'端。在一些示例中，封闭部分可逆地抑制聚合酶将第二核苷酸添加到所延伸的双链体的3'端。在一些示例中，第一核苷酸与封闭部分偶联。在一些示例中，封闭部分包括3'-封闭基团。在一些示例中，封闭部分与所延伸的双链体可逆地缔合。在一些示例中，该方法还包括检测封闭部分与所延伸的双链体的缔合。在一些示例中，该方法还包括检测所延伸的双链体中不存在封闭部分。在一些示例中，该方法还包括去除封闭部分以允许聚合酶将第二核苷酸添加到所延伸的双链体的3'端。
9、在一些示例中，在(d)中施加的第一力将聚合酶从与所延伸的双链体的3'端的接触中去除。在一些示例中，该方法包括包括施加第二力以将聚合酶从与所延伸的双链体的3'端的接触中去除，其中第二力大于第一力。
10、在一些示例中，该方法包括(f)施加第三力，从而将与双链体的3'端接触的聚合酶设置在纳米孔的第一侧上的孔口内或邻近该孔口。该方法还可包括，当施加第三力时：使用纳米孔抑制聚合酶移动到或进一步移动到孔口中；以及测量聚合酶的电特性的值。该方法可包括(g)使用操作(f)中测量的值来识别聚合酶与双链体的3'端的接触。在一些示例中，第三力小于第一力。在一些示例中，在操作(c)之后和操作(d)之前执行操作(f)。在一些示例中，第一核苷酸与封闭部分缔合。在一些示例中，操作(g)还包括使用操作(f)中测量的值来确认与第一核苷酸缔合的封闭部分的存在。
11、在一些示例中，聚合酶包括dna聚合酶。在一些示例中，聚合酶包括rna聚合酶。在一些示例中，聚合酶包括逆转录酶。
12、在一些示例中，第一核苷酸与封闭部分缔合，并且操作(e)还包括使用操作(d)中测量的值来确认与核苷酸缔合的封闭部分的存在。在一些示例中，该方法包括在操作(d)之后从第一核苷酸中去除封闭部分。在一些示例中，该方法包括，在去除封闭部分之后，(f)再次施加第一力，从而将所延伸的双链体的3'端设置在孔口内并且将多核苷酸的单链部分设置在孔口内。该方法可包括，当再次施加第一力时：使用纳米孔抑制所延伸的双链体的3'端易位至纳米孔的第二侧；以及测量所延伸的双链体的3'端和多核苷酸的单链部分的电特性的值。该方法可包括(g)使用操作(f)中测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种使用纳米孔对多核苷酸进行测序的方法，所述纳米孔包括第一侧、第二侧以及延伸通过所述第一侧和所述第二侧的孔口，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中操作(d)中测量的所述值包括所述纳米孔两端的电流、离子电流、电阻或电压降。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中操作(d)中测量的所述值包括所述纳米孔两端的电流、离子电流、电阻或电压降的噪声。
4.根据权利要求3所述的方法，其中操作(d)中测量的所述值包括所述噪声的标准偏差。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中操作(d)中测量的所述值至少基于所述多核苷酸的所述单链部分的M个核苷酸和所延伸的双链体的D对杂交核苷酸，其中M大于或等于2，并且其中D大于或等于1。
6.根据权利要求5所述的方法，其中M大于或等于3。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中D大于或等于2。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述单链部分的所述M个核苷酸中的至少一者包括经修饰的碱基，所述方法包括使用操作(d)中测量的所述值来
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括甲基化的碱基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法还包括当在操作(d)中施加所述第一力时抑制将另一个核苷酸添加到所延伸的双链体的所述3'端。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述纳米孔抑制另一个核苷酸的所述添加。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述纳米孔被取向为使得所述纳米孔的所述第一侧包括所述孔口的大部分。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述纳米孔被取向为使得所述纳米孔的所述第二侧包括所述孔口的大部分。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括：
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中使用与所述双链体的所述3'端接触的聚合酶添加所述第一核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括可逆地抑制所述聚合酶将第二核苷酸添加到所延伸的双链体的所述3'端。
17.根据权利要求16所述的方法，其中封闭部分可逆地抑制所述聚合酶将所述第二核苷酸添加到所延伸的双链体的所述3'端。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一核苷酸与所述封闭部分偶联。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述封闭部分包含3'-封闭基团。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述封闭部分与所延伸的双链体可逆地缔合。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括检测所述封闭部分与所延伸的双链体的缔合。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，所述方法还包括从所延伸的双链体中检测所述封闭部分的不存在。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，所述方法还包括去除所述封闭部分以允许所述聚合酶将所述第二核苷酸添加到所延伸的双链体的所述3'端。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，其中在(d)中施加的所述第一力将所述聚合酶从与所延伸的双链体的所述3'端的接触中去除。
25.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，所述方法还包括施加第二力以将所述聚合酶从与所延伸的双链体的所述3'端的接触中去除，其中所述第二力大于所述第一力。
26.根据权利要求15至25中任一项所述的方法，所述方法还包括：
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第三力小于所述第一力。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中在操作(c)之后和操作(d)之前执行操作(f)。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸与封闭部分缔合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中操作(g)还包括使用操作(f)中测量的所述值来确认与所述第一核苷酸缔合的所述封闭部分的存在。
31.根据权利要求15至30中任一项所述的方法，其中所述聚合酶包括DNA聚合酶。
32.根据权利要求15至30中任一项所述的方法，其中所述聚合酶包括RNA聚合酶。
33.根据权利要求15至30中任一项所述的方法，其中所述聚合酶包括逆转录酶。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸与封闭部分缔合，并且其中操作(e)还包括使用操作(d)中测量的所述值来确认与所述核苷酸缔合的所述封闭部...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种使用纳米孔对多核苷酸进行测序的方法，所述纳米孔包括第一侧、第二侧以及延伸通过所述第一侧和所述第二侧的孔口，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中操作(d)中测量的所述值包括所述纳米孔两端的电流、离子电流、电阻或电压降。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中操作(d)中测量的所述值包括所述纳米孔两端的电流、离子电流、电阻或电压降的噪声。
4.根据权利要求3所述的方法，其中操作(d)中测量的所述值包括所述噪声的标准偏差。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中操作(d)中测量的所述值至少基于所述多核苷酸的所述单链部分的m个核苷酸和所延伸的双链体的d对杂交核苷酸，其中m大于或等于2，并且其中d大于或等于1。
6.根据权利要求5所述的方法，其中m大于或等于3。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中d大于或等于2。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述单链部分的所述m个核苷酸中的至少一者包括经修饰的碱基，所述方法包括使用操作(d)中测量的所述值来识别所述经修饰的碱基。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括甲基化的碱基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法还包括当在操作(d)中施加所述第一力时抑制将另一个核苷酸添加到所延伸的双链体的所述3'端。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述纳米孔抑制另一个核苷酸的所述添加。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述纳米孔被取向为使得所述纳米孔的所述第一侧包括所述孔口的大部分。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述纳米孔被取向为使得所述纳米孔的所述第二侧包括所述孔口的大部分。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括：
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中使用与所述双链体的所述3'端接触的聚合酶添加所述第一核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括可逆地抑制所述聚合酶将第二核苷酸添加到所延伸的双链体的所述3'端。
17.根据权利要求16所述的方法，其中封闭部分可逆地抑制所述聚合酶将所述第二核苷酸添加到所延伸的双链体的所述3'端。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一核苷酸与所述封闭部分偶联。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述封闭部分包含3'-封闭基团。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述封闭部分与所延伸的双链体可逆地缔合。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括检测所述封闭部分与所延伸的双链体的缔合。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，所述方法还包括从所延伸的双链体中检测所述封闭部分的不存在。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，所述方法还包括去除所述封闭部分以允许所述聚合酶将所述第二核苷酸添加到所延伸的双链体的所述3'端。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，其中在(d)中施加的所述第一力将所述聚合酶从与所延伸的双链体的所述3'端的接触中去除。
25.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，所述方法还包括施加第二力以将所述聚合酶从与所延伸的双链体的所述3'端的接触中去除，其中所述第二力大于所述第一力。
26.根据权利要求15至25中任一项所述的方法，所述方法还包括：
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第三力小于所述第一力。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中在操作(c)之后和操作(d)之前执行操作(f)。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸与封闭部分缔合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中操作(g)还包括使用操作(f)中测量的所述值来确认与所述第一核苷酸缔合的所述封闭部分的存在。
31.根据权利要求15至30中任一项所述的方法，其中所述聚合酶包括dna聚合酶。
32.根据权利要求15至30中任一项所述的方法，其中所述聚合酶包括rna聚合酶。
33.根据权利要求15至30中任一项所述的方法，其中所述聚合酶包括逆转录酶。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸与封闭部分缔合，并且其中操作(e)还包括使用操作(d)中测量的所述值来确认与所述核苷酸缔合的所述封闭部分的存在。
35.根据权利要求34所述的方法，所述方法还包括在操作(d)之后从所述第一核苷酸中去除所述封闭部分。
36.根据权利要求35所述的方法，所述方法还包括，在去除所述封闭部分之后：
37.根据权利要求36所述的方法，所述方法还包括在操作(d)之前从所述第一核苷酸中去除所述封闭部分。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所延伸的双链体包含一种或多种核苷酸类似物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中相对于天然核苷酸，所述一种或多种核苷酸类似物增强了所延伸的双链体的稳定性。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述一种或多种核苷酸类似物包含一种或多种锁定核酸(lna)。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述一种或多种核苷酸类似物包含一种或多种2'-甲氧基(2'-ome)核苷酸。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述一种或多种核苷酸类似物包含一种或多种2'-氟化(2'-f)核苷酸。
43.根据权利要求38至42中任一项所述的方法，其中相对于天然核苷酸，所述一种或多种核苷酸类似物改变了所述电特性的所述值。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸包含所述一种或多种核苷酸类似物中的一者。
45.根据权利要求45所述的方法，其中所述一种或多种核苷酸类似物包含2'修饰。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的方法，其中所述一种或多种核苷酸类似物包含碱基修饰。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述第一力不足够强以引起所延伸的双链体的解离。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述第一力包括第一电压。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，其中操作(b)和(c)在所述第一力的不存在下执行。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中操作(c)在与所述第一力相反的第四力的存在下执行。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中第一锁定结构在所述纳米孔的所述第一侧上偶联到所述多核苷酸的所述3'端，所述第一锁定结构抑制所述多核苷酸的所述3'端通过所述孔口易位至所述纳米孔的所述第二侧。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一锁定结构是可去除的。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中第二锁定结构在所述纳米孔的所述第二侧上偶联到所述多核苷酸的所述5'端，所述第二锁定结构抑制所述多核苷酸的所述5'端通过所述孔口易位至所述纳米孔的所述第一侧。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述第二锁定结构是可去除的。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，所述方法还包括，在操作(d)之后：将所延伸的双链体与所述多核苷酸解离；以及
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中操作(a)包括：使所述纳米孔与所述多核苷酸接触，所述多核苷酸与基本上互补的多核苷酸杂交；以及
57.根据权利要求1至56中任一项所述的方法，其中所述纳米孔包括固态纳米孔。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中所述纳米孔包括生物纳米孔。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述生物纳米孔包括mspa。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含rna。
61.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含dna。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，其中所延伸的双链体包含与所述多核苷酸杂交的引物。
63.一种测序系统，包括：
64.根据权利要求63所述的系统，其中由所述电路测量的所述值包括所述纳米孔两端的电流、离子电流、电阻或电压降。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的系统，其中由所述电路测量的所述值包括所述纳米孔两端的电流、离子电流、电阻或电压降的噪声。
66.根据权利要求65所述的系统，其中由所述电路测量的所述值包括所述噪声的标准偏差。
67.根据权利要求63至66中任一项所述的系统，其中由所述电路测量的所述值至少基于所述多核苷酸的所述单链部分的m个核苷酸和所述双链体的d对杂交核苷酸，其中m大于或等于2，并且其中d大于或等于1。
68.根据权利要求67所述的系统，其中m大于或等于3。
69.根据权利要求67或权利要求68所述的系统，其中d大于或等于2。
70.根据权利要求67至69中任一项所述的系统，其中所述单链部分的所述m个核苷酸中的至少一者包含经修饰的碱基，所述电路被配置为使用由所述电路测量的所述值来识别所述经修饰的碱基。
71.根据权利要求70所述的系统，其中所述经修饰的碱基包括甲基化的碱基。
72.根据权利要求63至71中任一项所述的系统，其中当施加所述第一力时，抑制将另一个核苷酸添加到所述双链体的所述3'端。
73.根据权利要求72所述的系统，其中所述纳米孔抑制另一个核苷酸的所述添加。
74.根据权利要求63至73中任一项所述的系统，其中所述纳米孔被取向为使...
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