【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种检测猫细小病毒的引物、冻干微球和试剂盒。
技术介绍
1、猫细小病毒(feline panleukopenia virus，fpv)，又称为猫瘟病毒、猫泛白细胞减少症病毒，是临床上危害猫科动物健康的一种急性高度接触性传染病，其传染性强，致死率高。临床表现多以突然发高热、呕吐、腹泻、脱水、循环障碍、白细胞严重减少和肠炎为特征。fpv为单股负链dna病毒，全长约5000bp。fpv基因组包括2个开放阅读框(orf)，5＇端orf编码非结构蛋白，即早期转录的调节蛋白(ns1和ns2)；3＇端orf编码结构蛋白，即晚期转录的病毒衣壳蛋白(vp1和vp2)。
2、常见的fpv检测方法主要有临床症状观察、血清学检测、免疫血清学试验、病毒分离、胶体金试纸板检测、免疫荧光试纸检测、普通pcr扩增、实时荧光定量pcr检测、实时荧光环介导等温扩增检测等。病毒分离培养是鉴定fpv的金标准，特异性较强，但操作复杂并费时费力，需要实验操作熟练的技术人员在专业的细胞培养设备中培养增殖，并且病毒分离和血凝试验在病毒感染前期容易造成假阴性结果，灵敏度不高。应用电子显微镜可以对病毒这类超微小的病原体进行形态学观察，这是直接对病原体进行判定的标准方法，但是受制于设备昂贵、养护复杂，还要求观测人员有熟练判别的经验，不能实时检测并且难以应用于现场诊断，故存在一定局限性。胶体金试纸板检测是通过胶体金免疫层析法，样本抗原与胶体金标记的抗体结合，形成金标抗原抗体复合物并检测出结果，此方法操作简单迅速，但当病毒含量较低时容易出现假阴
3、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供检测猫细小病毒的引物，以解决上述问题中的至少一种。
2、本专利技术的第二目的在于提供一种检测猫细小病毒的冻干微球。
3、本专利技术的第三目的在于提供上述引物或者冻干微球在制备检测猫细小病毒的产品中的应用。
4、本专利技术的第四目的在于提供一种用于检测猫细小病毒的试剂盒。
5、为了实现以上目的，提出以下技术方案：
6、第一方面，本专利技术提供了检测猫细小病毒的环介导等温扩增引物，所述环介导等温扩增引物为如下引物组合1-3中的任一种：
7、引物组合1的引物序列如seq id no.1-seq id no.6所示；
8、引物组合2的引物序列如seq id no.7-seq id no.11所示；
9、引物组合3的引物序列如seq id no.12-seq id no.16所示。
10、第二方面，本专利技术提供了一种检测猫细小病毒的冻干微球，主要由环介导等温扩增反应液和冻干保护剂的混合液经过冷冻干燥后制备得到；
11、所述环介导等温扩增反应液包括所述的环介导等温扩增引物。
12、作为进一步技术方案，所述环介导等温扩增反应液包括2u/反应-8u/反应的bst聚合酶、0.03mm-1mm的dntp、1mm-10mm的氯化镁、10mm-300mm的氯化钾、0.1mm-8mm的硫酸铵、0.01％-0.5％的诺纳德(r)p-40、0.5mm-5mm的氢氧化钠、0.833μm-8.33μm的荧光染料和所述的环介导等温扩增引物；
13、所述环介导等温扩增引物中，外引物f3的工作浓度为0.5mm-5.0mm、外引物b3的工作浓度为0.5mm-5.0mm、内引物fip的工作浓度为2mm-16mm、内引物bip的工作浓度为2mm-16mm、环介导引物lf的工作浓度为1mm-6mm、环介导引物lb的工作浓度为1mm-6mm。
14、作为进一步技术方案，所述环介导等温扩增反应液包括8u/反应的bst聚合酶、0.67mm的dntp、6mm的氯化镁、30mm的氯化钾、0.2mm的硫酸铵、0.06％的诺纳德(r)p-40、0.5mm的氢氧化钠、0.833μm-8.33μm的荧光染料和所述的环介导等温扩增引物；
15、所述环介导等温扩增引物中，外引物f3的工作浓度为2.0mm、外引物b3的工作浓度为2.0mm、内引物fip的工作浓度为10mm、内引物bip的工作浓度为10mm、环介导引物lf的工作浓度为3mm、环介导引物lb的工作浓度为3mm。
16、作为进一步技术方案，所述冻干保护剂包括海藻糖、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸酯、肌醇、环糊精和d-山梨醇；
17、所述混合液中，所述海藻糖的终浓度为0.01％-2.0％，所述苯甲酸钠的终浓度为0.01％-0.3％，所述对羟基苯甲酸酯的终浓度为0.01％-0.5％，所述肌醇的终浓度为0.01％-0.05％，所述环糊精的终浓度为0.1％-1.5％，所述d-山梨醇的终浓度为0.01mm-2mm。
18、作为进一步技术方案，所述混合液中，所述海藻糖的终浓度为0.75％，所述苯甲酸钠的终浓度为0.3％，所述对羟基苯甲酸酯的终浓度为0.1，所述肌醇的终浓度为0.05％，所述环糊精的终浓度为0.2％，所述d-山梨醇的终浓度为0.01mm。
19、作为进一步技术方案，所述冷冻干燥的工艺包括：-48℃至-52℃预冻1h-5h，-43℃至-47℃升华干燥0.17h-1h，-38℃至-42℃升华干燥1h-5h，-33℃至-37℃升华干燥0.17h-0.5h，-28℃至-32℃升华干燥0.17h-0.5h，-23℃至-27℃升华干燥0.17h-0.5h，-18℃至-22℃升华干燥0.17h-0.5h，-13℃至-17℃升华干燥0.17h-0.5h，-8℃至-12℃升华干燥0.17h-0.5h，-3℃至-7℃升华干燥0.17h-0.5h，0℃解析干燥0.17h-0.5h，3℃至7℃解析干燥0.17h-0.5h，8℃至12℃解析干燥0.17h-0.5h，13℃至17℃解析干燥0.17h-0.5h，18℃至22℃解析干燥1h-4h；
20、所述冷冻干燥的真空度小于等于20pa。
21、第三方面，本专利技术提供了上述环介导等温扩增引物，或者冻干微球在制备检测猫细小病毒的产品中的应用。
22、第四方面，本专利技术提供了一种用于检测猫细小病毒的试剂盒，包括所述的冻干微球和复溶剂；
23、所述复溶剂用于复溶冻干微球。
24、作为进一步技术方案，所述复溶剂包括10mm-300mm ph值为9.0的tris-hcl、10mm-300mm的kcl，0.1mm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测猫细小病毒的环介导等温扩增引物，其特征在于，所述环介导等温扩增引物为如下引物组合1-3中的任一种：
2.一种检测猫细小病毒的冻干微球，其特征在于，主要由环介导等温扩增反应液和冻干保护剂的混合液经过冷冻干燥后制备得到；
3.根据权利要求2所述的冻干微球，其特征在于，所述环介导等温扩增反应液包括2U/反应-8U/反应的Bst聚合酶、0.03mM-1mM的dNTP、1mM-10mM的氯化镁、10mM-300mM的氯化钾、0.1mM-8mM的硫酸铵、0.01％-0.5％的诺纳德(R)P-40、0.5mM-5mM的氢氧化钠、0.833μM-8.33μM的荧光染料和权利要求1所述的环介导等温扩增引物；
4.根据权利要求3所述的冻干微球，其特征在于，所述环介导等温扩增反应液包括8U/反应的Bst聚合酶、0.67mM的dNTP、6mM的氯化镁、30mM的氯化钾、0.2mM的硫酸铵、0.06％的诺纳德(R)P-40、0.5mM的氢氧化钠、0.833μM-8.33μM的荧光染料和权利要求1所述的环介导等温扩增引物；
5.根据权利要求2所述的冻干
6.根据权利要求5所述的冻干微球，其特征在于，所述混合液中，所述海藻糖的终浓度为0.75％，所述苯甲酸钠的终浓度为0.3％，所述对羟基苯甲酸酯的终浓度为0.1，所述肌醇的终浓度为0.05％，所述环糊精的终浓度为0.2％，所述D-山梨醇的终浓度为0.01mM。
7.根据权利要求2所述的冻干微球，其特征在于，所述冷冻干燥的工艺包括：-48℃至-52℃预冻1h-5h，-43℃至-47℃升华干燥0.17h-1h，-38℃至-42℃升华干燥1h-5h，-33℃至-37℃升华干燥0.17h-0.5h，-28℃至-32℃升华干燥0.17h-0.5h，-23℃至-27℃升华干燥0.17h-0.5h，-18℃至-22℃升华干燥0.17h-0.5h，-13℃至-17℃升华干燥0.17h-0.5h，-8℃至-12℃升华干燥0.17h-0.5h，-3℃至-7℃升华干燥0.17h-0.5h，0℃解析干燥0.17h-0.5h，3℃至7℃解析干燥0.17h-0.5h，8℃至12℃解析干燥0.17h-0.5h，13℃至17℃解析干燥0.17h-0.5h，18℃至22℃解析干燥1h-4h；
8.权利要求1所述的环介导等温扩增引物，或者权利要求2-7任一项所述的冻干微球在制备检测猫细小病毒的产品中的应用。
9.一种用于检测猫细小病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2-7任一项所述的冻干微球和复溶剂；
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述复溶剂包括10mM-300mM pH值为9.0的Tris-HCl、10mM-300mM的KCl，0.1mM-50mM的硫酸铵和0.009％-0.6％的诺纳德(R)P-40。
...【技术特征摘要】
1.检测猫细小病毒的环介导等温扩增引物，其特征在于，所述环介导等温扩增引物为如下引物组合1-3中的任一种：
2.一种检测猫细小病毒的冻干微球，其特征在于，主要由环介导等温扩增反应液和冻干保护剂的混合液经过冷冻干燥后制备得到；
3.根据权利要求2所述的冻干微球，其特征在于，所述环介导等温扩增反应液包括2u/反应-8u/反应的bst聚合酶、0.03mm-1mm的dntp、1mm-10mm的氯化镁、10mm-300mm的氯化钾、0.1mm-8mm的硫酸铵、0.01％-0.5％的诺纳德(r)p-40、0.5mm-5mm的氢氧化钠、0.833μm-8.33μm的荧光染料和权利要求1所述的环介导等温扩增引物；
4.根据权利要求3所述的冻干微球，其特征在于，所述环介导等温扩增反应液包括8u/反应的bst聚合酶、0.67mm的dntp、6mm的氯化镁、30mm的氯化钾、0.2mm的硫酸铵、0.06％的诺纳德(r)p-40、0.5mm的氢氧化钠、0.833μm-8.33μm的荧光染料和权利要求1所述的环介导等温扩增引物；
5.根据权利要求2所述的冻干微球，其特征在于，所述冻干保护剂包括海藻糖、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸酯、肌醇、环糊精和d-山梨醇；
6.根据权利要求5所述的冻干微球，其特征在于，所述混合液中，所述海藻糖的终浓度为0.75％，所述苯甲酸钠的终浓度为0.3％，所述对羟基苯甲酸酯的终浓度为0.1，所述肌醇的终浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：王量，刘娉婷，陈东，凌世生，
申请(专利权)人：杭州安旭生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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