【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及应用，属于生物化学与分子生物学领域。
技术介绍
1、大肠杆菌作为生物发酵工业中常用的工业微生物，在代谢产物生产的过程中会面临着诸如高温、酸/碱、渗透压等挑战，在有机酸的生产过程中面临的酸胁迫会严重影响微生物的生长以及降低生产效能。虽然可以通过向发酵过程中添加中和剂改善发酵液的酸性环境，但是这可能会带来大肠杆菌细胞内外渗透压的改变，以及增加下游工艺成本和产生大量废水。因此，在生物发酵过程中使用耐酸菌株更具经济和应用效益。
2、目前，针对大肠杆菌耐酸性改造方法有代谢途径改造、人工诱变、全局转录因子工程以及定向进化。而转录因子作为改变复杂微生物代谢途径的调控因子，在转录水平的基因调控方面具有多位点调控的独特优势，弥补了单一关键基因作用的缺陷，而定向进化相比于自然进化具有能够在短时间内筛选得到目标表型的优势。
3、常见的定向进化手段有基因改组、易错pcr(ep-pcr)、定点突变或定点饱和突变等。其中对于转录因子的ep-pcr的定向进化被广泛应用大肠杆菌耐酸、渗透压胁迫、高温等方面的研究。大肠杆菌作为代表性底盘微生物，其基因克隆表达系统具有生长周期短，遗传性能稳定，操作方法简单，表达系统完善等优点，对其进行优良性状的改造更能满足工业生产的需求。
4、现有技术cn112442471b公开了通过利用大肠杆菌表达dtdp-葡萄糖焦磷酸化酶2rffh和/或编码dtdp-葡萄糖4,6-脱水酶rffg提高了大肠杆菌工程菌的乳酸胁迫抗性；cn112391330a公
5、因此，筛选得到耐酸性能强的大肠杆菌，是目前亟需解决的问题，具有极高的经济价值与实用价值。
技术实现思路
1、针对以上问题，本专利技术采用过表达大肠杆菌自身的形态基因bola，构建得到大肠杆菌工程菌，提高了抗酸胁迫能力；并在此基础上，本专利技术对形态基因bola进行易错pcr随机突变，进一步提高了大肠杆菌工程菌的抗酸胁迫能力，对hcl、琥珀酸和柠檬酸均有较强的耐受能力。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌过表达了形态基因蛋白bola。
3、在一种实施方式中，所述形态基因蛋白bola的氨基酸序列如seq id no.1～5所示。
4、在一种实施方式中，所述形态基因蛋白bola的启动子核苷酸序列如seq id no.6～10所示。
5、在一种实施方式中，所述形态基因蛋白bola的核苷酸序列如seq id no.11～15所示。
6、在一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌使用puc19、pet-28a(+)、pcdfduet-1作为过表达载体，可选的所述大肠杆菌工程菌使用puc19作为过表达载体。
7、在一种实施方式中，所述宿主大肠杆菌的有e.coli mg1655、e.coli bl21、e.colijm109，可选的所述大肠杆菌为e.coli mg1655。
8、本专利技术的第二个目的是提供任一上述大肠杆菌工程菌的构建方法，所述方法为：去除质粒中的启动子，将形态基因bola连接到质粒中，并添加终止子rrnbt1t2，将质粒转入大肠杆菌中；其中终止子rrnbt1t2的核苷酸序列如seq id no.16所示。
9、在一种实施方式中，所述方法为：去除质粒puc19中的lac启动子，插入核苷酸序列如seq id no.6～10所示的启动子，并插入来自大肠杆菌mg1655基因组上的rrnbt1t2终止子，将形态基因bola连接至质粒pucx-ter中，将质粒转入大肠杆菌中。
10、在一种实施方式中，形态基因bola的核苷酸序列如seq id no.11～15所示。
11、在一种实施方式中，将过表达大肠杆菌基因组上的bola基因的质粒通过易错pcr的方法定向进化，筛选得到优良菌株e.coil-5-21-5、e.coil-6-9-10、e.coil-6-9-15、e.coil-6-15-25。
12、在一种实施方式中，在普通pcr的基础上，改变反应体系中的mg2+、mn2+控制在5和0.2mm的条件下，并通过两轮pcr反应以及改变pcr程序中的退火温度将碱基平均突变率控制在0.3-0.6％。
13、在一种实施方式中，抗酸胁迫能力包括，在ph 4.5琥珀酸酸化的条件下，生物量最高提高18.87％，在ph4.5柠檬酸酸化的条件下最高提高24.89％，在ph4.5 hcl酸化的条件下最高提高29.01％。
14、在一种实施方式中，抗酸胁迫能力包括，通过透射电子显微镜(tem)观察细胞在中度酸性(ph 5.0)条件下的细胞形态变化，发现筛选得到的突变菌株在细胞长度上相比于wt以及bola+菌株都有明显减少，e.coil-5-21-5、e.coil-6-9-10、e.coil-6-9-15菌株的长度相比于wt分别减少26.14％、35.06％以及28.32％，细胞趋向更短的杆状转变，增强了细胞在不良环境下的聚集能力。
15、本专利技术的第三个目的是提供形态基因蛋白bola在提高大肠杆菌抗酸胁迫中的应用。
16、本专利技术还提供任一上述大肠杆菌工程菌在制备有机酸中的应用。
17、在一种实施方式中，所述有机酸包括：琥珀酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、甲酸。
18、有益效果
19、本专利技术采用过表达大肠杆菌自身的形态基因bola，构建得到大肠杆菌工程菌，提高了抗酸胁迫能力；并在此基础上，本专利技术对形态基因bola进行易错pcr随机突变，进一步提高了大肠杆菌工程菌的抗酸胁迫能力，对hcl、琥珀酸和柠檬酸均有较强的耐受能力。具体的：
20、(1)在不同ph条件下，过表达bola基因的大肠杆菌工程菌e.coli-mg1655-bola+菌株相比于e.coli mg1655菌株以及bola缺失菌株e.coli-mg1655-δbola，在生物膜形成能力上具有显著优势，其在ph 4.5的条件下是e.coli mg1655的2.08倍，ph 5.0的条件下是e.coli mg1655的2.27倍，在ph 7.0的条件下是e.coli mg1655的6.31倍，在极端酸性(ph2.5)的条件下，大肠杆菌工程菌e.coli-mg1655-bola+相比e.coli mg1655菌株存活能力提高100倍；
21、(2)基于bola基因具有潜在抗酸能力，对包含启动子在内的bola基因进行易错pcr定向进化筛选得到的突变菌株e.coli-5-21-5在琥珀酸酸化至5.0的条件下生物量比对照组菌株wt提高18.88％，在琥珀酸酸化至4.5的条件下四株突变菌株生物量提高11.35-16本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌过表达了形态基因蛋白BolA。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述形态基因蛋白BolA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～5所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述形态基因蛋白BolA是以核苷酸序列如SEQ ID NO.6～10所示的启动子启动表达。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌使用pUC19、pET-28a(+)、pCDFDuet-1作为过表达载体。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌的宿主为E.coliMG1655、E.coliBL21、E.coli JM109。
6.权利要求1～5任一所述大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法为：去除质粒中原本的启动子，将形态基因bolA及其启动子连接到质粒中，并添加终止子rrnBT1T2，将质粒转入大肠杆菌中；其中，启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～10所示，终止子rrnB
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，形态基因bolA的核苷酸序列如SEQ IDNO.11～15所示。
8.形态基因蛋白BolA在提高大肠杆菌抗酸胁迫中的应用。
9.权利要求1～5任一所述大肠杆菌工程菌在制备有机酸中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述有机酸包括：琥珀酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、甲酸。
...【技术特征摘要】
1.一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌过表达了形态基因蛋白bola。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述形态基因蛋白bola的氨基酸序列如seq id no.1～5所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述形态基因蛋白bola是以核苷酸序列如seq id no.6～10所示的启动子启动表达。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌使用puc19、pet-28a(+)、pcdfduet-1作为过表达载体。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌的宿主为e.colimg1655、e.colibl21、e.coli jm109。...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯守帅，陈宗玲，杨海麟，霍星宇，车金名，万佳利，邓美仪，龙凌凤，仝艳军，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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