苔藓表达促进区域制造技术

公开的是编码野生型细胞核来源的苔藓表达促进区域（ＭＥＰＲ）的分离核酸分子以及使用这种ＭＥＰＲ制备重组多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
苔藓表达促进区域本申请是申请号2004800229689，申请日为2004年7月30日的同名专利的分案申请。本专利技术涉及分离的核酸分子，这些分子促进多肽在遗传修饰的真核宿主细胞中的 表达。蛋白质类物质(蛋白质、肽、多肽及其片段，以及这些分子的翻译后修饰的形式， 在此后被称为“多肽”，在例如实施例部分中与“蛋白质”作为同义词一同使用)在遗传修饰 的细胞中的表达是提供这些通常是稀缺或者贵重物质制备物的主要来源。为了在遗传修饰 的宿主细胞中表达这些多肽，需要有对这一表达有正面控制(“激活”、“促进”)的DNA区域 的存在。启动子是这种区域的重要实例，它们使RNA聚合酶结合到DNA上，起始DNA转录为 mRNA (Watson 等人，“RecombinantDNA (1992)，Chapter I. 1 和 2)。作为研究植物生理和发育的有用研究对象，苔藓(moss)吸引了越来越多的注意 力，因为它们简单的特征(苔藓位于高等植物进化的最底部)为高等植物的复杂生物学提 供了信息。苔藓简单的形态学和具有优势的培养可能性使它们成为研究植物生理学和发育 生物学流行的模型生物。苔藓可以毫不费力地使用包括纯性培养(axenicculture)在内的 体外技术，在控制的条件下培养，不仅仅在培养皿中而且在液体培养基例如生物反应器中。 单倍体的配子体可以在无菌的培养基中进行光自养生长，并且很容易在细胞水平观察到。苔藓的另一个主要优势是它们的转化能力尽管有很多研究，但是在植物中的靶 向整合事件很少达到10_4，这阻碍了植物功能基因组学的基因靶向方法的一般使用。与所 有其他至今被检测的植物相比，同源DNA序列在苔藓(特别是已经建立的苔藓模型生物例 如小立碗藓(Physcomitrella patens)(其分子遗传学的综述参见Reski，1999))的基因组 中的整合主要是以同源重组的方式出现在靶向的位置上。通常使用PEG介导的原生质体摄 取质粒DNA、粒子枪法DNA转移、电穿孔以及显微注射(Cove等人，1997)进行苔藓的转化， 这些很容易进行。根据转化构建体的设计主要会出现随机或者靶向的整合。尽管使用苔藓作为科学工具用于植物生理学研究，但是至今为止使用苔藓在苔藓 细胞中制备异源重组多肽仍然是相当有限，尽管已经具备了有效的制备方法(例如根据EP 1 206 561 A中的描述培养原丝体苔藓组织)。在真核宿主细胞特别是动物细胞或者高等植物细胞中转化技术的一个主要限制 总是缺少有效的启动子用于在这样的宿主细胞中进行外源基因的高的组成型表达。基于这 个目的，花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子已经被广泛地用于许多植物转化系统中(参见 例如W001/25456A)，但是在一些植物物种中CaMV 35S启动子活性低(特别是单子叶植物例 如水稻(McElroy等人，1991，))。对于单子叶植物的转化，已经使用了水稻肌动蛋白15' 区域用于蛋白质的异源表达(McElroy等人，1991，)。但是仍然存在对新型表达促进手段的 不断需要用于在遗传修饰的真核宿主细胞中表达重组(外源)多肽。对于苔藓，特别是小立碗藓至今为止仍然没有发表同源的(在这里同源的定义 是苔藓来源的)适当的来自细胞核的表达启动子或者其他来自细胞核的表达启动序列 (Holtdorf等人，2002)。研究人员因此已经使用了异源的(在这里异源的定义是非苔藓来源的)启动子用于表达选择标记基因和其他目的基因。但是这些启动子中只有很少能够 在某些苔藓中可靠地起作用(例如CaMV 35S启动子；在Holtdorf等人，2002中予以总结； CaMV 35S启动子在某些其他的物种中不起作用(Zeidler等人，1999) ；TET-启动子(在 Reski (1998)中予以综述)。因此，已经在本领域内开发了用于对苔藓进行遗传操作的其他方法，例如基因捕 获和增强子捕获系统(Hiwatashi等人，2001 ；但是还使用了(缩短的)CaMV 35S启动子； 作者在瞬时表达实验中表明这个35S启动子的缩短形式是作为一个弱启动子起作用；实际 上，这篇文章涉及了在增强子捕获菌株中表达报告基因，但是没有显示这一表达与任何苔 藓的调控元件有任何联系)。尽管在以上提及的在苔藓中使用同源重组的研究中，异源启动子的使用是必要的 (因此不需要同源启动子，而且它们在大多数情况下是没有用的)，但是对于用于工业使用 苔藓制备重组多肽或者用于过量表达同源多肽的适宜的苔藓来源的表达促进手段的需要 仍然存在并且尚未解决。这些表达促进手段应该使得在应用的培养条件下存在稳定和组成 型的表达，并且应该优选地使表达与CaMV35S启动子的表达相当或者更高。因此，本专利技术提供了编码苔藓表达促进区域(MEPR)，即来自野生型苔藓的表达促 进区域的分离的核酸分子。本专利技术中提供了苔藓来源的表达区域(即来自野生型苔藓的细 胞核来源的区域)，它可以使在遗传修饰的宿主细胞中特别是在苔藓中有组成型的表达，这 样就解决了在现有技术中提出的对于这种工具的需要(Holtdorf等人，2002 ；Schaefer等 人，2002)。根据本专利技术，MEPR的基本特征还有MEI5R的表达促进活性是在特异宿主细胞中起 作用的异源启动子(例如在小立碗藓中用于表达重组多肽的CaMV 35S启动子)表达促进 活性的至少30%，优选为至少50%，因为不具有这种表达促进活性的苔藓启动子不能被正 确地用于解决本专利技术的目标，因此不被当做MERP。因此，根据本专利技术MEra从野生型苔藓，即没有通过引入非苔藓物种的启动子(例 如高等植物或者(植物)病原的启动子例如CaMV 35S启动子或者TET启动子)被遗传修 饰的苔藓，的细胞核中分离。还很清楚，具有微小序列改变(例如在对于表达促进活性没有 负面影响(破坏)的区域中有1，2，3，4，或者5个碱基的交换)的MEPR，也被认为是根据本 专利技术的MEra，它们可能是由于例如天然植株序列变异或者由于在MEI5R的分离过程中出现 的事件而造成的。用于分析表达促进活性的方法或者用于分析这种微小序列改变对于这一 活性的影响的方法是技术人员已知的(例如通过与已知的CaMV 35S构建体进行比较)并 且在下面的实施例部分中进行描述。根据本专利技术，非孢子体(sphorophyte)特异的METO表达促进被定义为组成型 MEPR,优选地MEI3R促进在来自配子体的细胞中的表达，更为优选地，MEPR促进在原丝体细 胞中的表达。根据本专利技术，组成型表达优选地被定义为蛋白质的表达导致该蛋白在一般用于光 自养生长的苔藓的液体培养条件下(例如摇瓶培养，生物反应器培养(EP 1 206 561 A)) 以及用于在下面描述的瞬时表达系统的条件下具有可以被检出的量。因此，组成型表达应 当给予根据本专利技术的MERP，优选地不必在培养基中添加特殊培养添加物，还有优选地不必 在培养基中添加糖、植物激素或者这些物质混合物。组成型表达应该以稳定的形式进行；尽管它可能是瞬时的。在本专利技术的说明中使用的术语“苔藓”包括所有的苔藓类植物(苔类(hepatics) 或者地钱(liverworts)、角苔(hornworts)和苔藓)。苔藓的特点是它们的异型世代交替， 即两个细胞核本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码野生型细胞核来源的苔藓表达促进区域（ＭＥＰＲ）的分离的核酸分子。

【技术特征摘要】
EP 2003-8-11 03450184.1编码野生型细胞核来源的苔藓表达促进区域(MEPR)的分离的核酸分子。2.根据权利要求1的分离的核酸分子，其特征在于MEI5R选自立碗藓属 (Physcomitrella)、葫芦藓属(Funaria)、泥炭藓属(Sphagnum)、角齿藓属(Ceratodon)、地 钱属(Marchantia)以及 Sphaerocarpos 的 MEPR，优选地选自小立碗藓(Physcomitrella patens)、葫声藓(Funaria hygrometrica)禾口地钱(Marchantia po lymorpha)的 MEPR03.根据权利要求1或者2的分离的核酸分子，其特征在于MEI5R选自序列编号1到27 的序列或者其表达促进片段。4.根据权利要求1到3中任何一项的分离的核酸分子，其特征在于它包含苔藓启动子 以及优选地，5' UTR区域和/或5'内含子和/或3' UTR05.根据权利要求1到4中任何一项的分离的核酸分子，其特征在于MEI5R具有的表达促 进活性至少与花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子的表达促进活性相等。6.根据权利要求1到5中任何一项的分离的核酸分子，其特征在于MEI5R具有的表 达促进活性至少是花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子表达促进活性的200%，优选至少是 500%，特别至少是1000%。7.根据权利要求1到6中任何一项的分离的核酸分子，其特征在于它还包含重组多肽 产物的编码区，所述的编码区在MEra的控制下。8.根据权利要求1到7中任何一项的分离的核酸分子，其特征在于它还包含选择标记。9.根据权利要求1到7中任何一项的分离的核酸分子，其特征在于它还包含与将要用 其转化的物种的基因组序列同源的序列，以使在该物种中靶向整合。10.根据权利要求1到5中任何一项的分离的核酸分子，其特征在于核酸分子以反义或 者核酶分子的形式提供。11.在真核宿主细胞中表达重组多肽产物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M罗德里格斯佛朗哥，W约斯特，A威斯，G戈尔，
申请(专利权)人：格里革新生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]