【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于天然产物分离，具体涉及一种用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法及其应用。
技术介绍
1、“多成分-多靶点-多通路-多效应”是中药及天然药物等传统药物发挥生物功能的主要形式，这决定了在中药及天然药物的研发、生产等各个环节中常涉及对活性成分混合物的分离分析。然而，这些被分离的混合物往往具有不同的化学结构骨架、官能团及性质，因此天然产物复杂体系的分离分析过程往往需要更加多样的色谱系统类型（不同的固定相和流动相）。逆流色谱（counter-current chromatography，ccc）是利用液-液两相的逆流分配实现分离的色谱技术。与反相高效液相色谱(rp-hplc)技术相比，ccc不仅消除了固体固定相的使用，操作形式灵活，而且溶剂系统具有无限的选择，为中药活性成分制备、中药指纹图谱、代谢组学复杂样品前处理等领域提供了更为经济、合理的分离手段。然而机遇与挑战并行，液-液两相的溶剂系统是ccc执行中药及天然产物分离的巨大优势，同时溶剂系统条件选择与优化，一直是个充满不确定性且费时费力的试错过程。
2、多种ccc溶剂系统的快速选择是优化ccc溶剂系统条件的基础。目前针对最常用的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（hemwat）溶剂系统，国内外专家提出了许多有用的溶剂系统选择策略：溶剂族的使用为ccc用户选择溶剂系统提供了总体方向；采用通用官能团活度系数(unifac)模型、真实溶剂类导体筛选模型(cosmo-rs)、非随机双液体(nrtl)模型等理论模型计算溶剂系统各相的溶剂构成和化合物溶解度，可以实
技术实现思路
1、针对现有技术中ccc溶剂系统条件优化缺乏有效性的问题，本专利技术提供了一种用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法及其应用，通过改变正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水系统中醇类溶剂的种类（甲醇、乙醇、异丙醇）及其溶剂配比，进而改变溶剂系统性质，建立描述不同溶剂系统分离特性和适用范围的数学方法，进而建立了正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水逆流色谱溶剂系统的高效优化策略。
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、一种用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，包括以下步骤：
4、（1）对天然产物样品采用高效液相色谱(hplc)分析，计算目标化合物b%及多种成分的平均值%；
5、
6、式中，tr为保留时间；td为高效液相色谱仪自身的延迟时间；ƙ为梯度斜率；b0%为梯度中初始甲醇比例，b%为样品出峰时柱前端甲醇实际比例；
7、（2）根据使用的色谱柱的种类，将天然产物样品多种成分的平均值%带入溶剂相应的溶剂系统数学模型，计算出逆流色谱的溶剂系统；所述的溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水系统；
8、（3）采用摇瓶实验对计算出的正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水系统进行验证，hplc分析不同溶剂系统上、下相中样品的峰面积，计算分配系数(k)；
9、
10、其中，k为分配系数，au为上相中样品的峰面积；al为下相中样品的峰面积；
11、（4）对k值偏差较大的溶剂系统进行校正，得到多种适合样品分离溶剂系统，0.25<k<2.5；
12、（5）计算天然产物样品中相邻色谱峰的选择性因子( α)，选择各相邻色谱峰 α值最大或 α≥ 1.5的溶剂系统条件，即完成了溶剂系统的条件优化，得到用于天然产物复杂样品分离的最佳逆流色谱溶剂系统；
13、
14、其中，为相邻色谱峰的选择性因子，k2为相邻色谱峰第2个色谱峰的分配系数；k1为相邻色谱峰第1个色谱峰的分配系数。
15、进一步地，步骤（1）中所述的色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱；所述的正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水系统、正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水系统和正己烷/乙酸乙酯/异丙醇/水系统。
16、进一步地，所述的十八烷基键合硅胶色谱柱为agilent zorbax sb -c18，5 μm,4.6×250 mm、agilent extend -c18，5 μm, 4.6×250 mm、aglient tc-c18，5 μm, 4.6×150 mm、diamonsil c18，5 μm, 4.6×250 mm或thermo hypersil gold，5 μm, 4.6×250mm。
17、进一步地，不同的正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水系统以9×9图表形式展现时，针对纵向溶剂系统族（1:9:4:6 → 8:2:4:6）、横向溶剂系统族（5:5:2:8 → 5:5:8:2）、对角溶剂系统族（3:7:1:9 → 9:1:7:3），基于不同色谱柱建立的正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水溶剂系统条件优化数学模型如下（1）-（5）所示，正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水纵向溶剂系统族的溶剂构成：x:(10-x):4:6 (x为正己烷占比，1 ≤ x ≤ 9)，横向溶剂系统族的溶剂构成：5:5:y:10-y (y为甲醇占比，1 ≤ y ≤ 8)，对角溶剂系统族的溶剂构成：x:(10-x):(x-2):(12-x) (3 ≤ x ≤ 9)；正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水系统中纵向溶剂系统族的溶剂构成：m:(10-m):4:6 (m为正己烷占比，1 ≤m ≤ 9)，横向溶剂系统族的溶剂构成：5:5:n:(10-n) (n为乙醇占比，1 ≤ n ≤ 8)，对角溶剂系统族的溶剂构成：m:(10-m):(m-2):(12-m) (3 ≤ m ≤ 9)；正己烷/乙酸乙酯/异丙醇/水系统中纵向溶剂系统族的溶剂构成：e:(10-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，步骤（1）中所述的色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱；所述的正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水系统、正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水系统和正己烷/乙酸乙酯/异丙醇/水系统。
3.根据权利要求2所述的用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，所述的十八烷基键合硅胶色谱柱为Agilent ZORBAX SB -C18，5 μm, 4.6×250 mm、Agilent Extend -C18，5 μm, 4.6×250 mm、Aglient TC-C18，5 μm, 4.6×150 mm、Diamonsil C18，5 μm, 4.6×250 mm或Thermo Hypersil GOLD，5 μm, 4.6×250 mm。
4.根据权利要求3所述的用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，不同的正己烷/乙酸
5.根据权利要求1所述的用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，步骤（3）中所述的摇瓶实验的操作方法为：在25 ± 3 ℃条件下，配置步骤（2）计算出的逆流色谱的溶剂系统，充分摇匀静置平衡后，等体积移取上相溶剂和下相溶剂于样品瓶中，加入天然产物样品，再次充分摇匀静置平衡后，移取等体积的上相溶剂和下相溶剂，吹干后，用甲醇溶解、过滤，即为步骤（3）HPLC检测样品。
6.根据权利要求1所述的用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，步骤（4）中利用K值进行校正的方法为：
7.根据权利要求1所述的用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，步骤（1）液相色谱中流动相A为水，流动相B为甲醇，梯度洗脱。
8.一种权利要求1~7任一项所述的可用于中药及天然产物复杂样品体系的逆流色谱溶剂系统高效优化方法和应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，步骤（1）中所述的色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱；所述的正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水系统、正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水系统和正己烷/乙酸乙酯/异丙醇/水系统。
3.根据权利要求2所述的用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，所述的十八烷基键合硅胶色谱柱为agilent zorbax sb -c18，5 μm, 4.6×250 mm、agilent extend -c18，5 μm, 4.6×250 mm、aglient tc-c18，5 μm, 4.6×150 mm、diamonsil c18，5 μm, 4.6×250 mm或thermo hypersil gold，5 μm, 4.6×250 mm。
4.根据权利要求3所述的用于天然产物复杂样品分离的逆流色谱溶剂系统的优化方法，其特征在于，不同的正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水系统以9×9图形式展现时，针对纵向溶剂系统族（1:9:4:6 → 8:2:4:6）、横向溶剂系统族（5:5:2:8 → 5:5:8:2）、对角溶剂系统族（3:7:1:9 → 9:1:7:3），基于不同色谱柱建立的正己烷/乙酸乙酯/醇类溶剂/水溶剂系统条件优化数学模型如下（1）~（5）所示，正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水纵向溶剂系统族的溶剂构成：x:(10-x):4:6 (x为正己烷占比，1 ≤ x ≤ 9)，横向溶剂系统族的溶剂构成：5:5:y:10-y (y为甲...
【专利技术属性】
技术研发人员：王旭，孙启慧，容蓉，杨勇，高天，栾秀梅，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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