【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物组织切片，尤其涉及一种用于植物组织整体染色的方法。
技术介绍
1、将植物组织进行染色，适用于研究植物器官的形态和结构，通常会将植物组织进行生物制片，再进行染色，以便于观察植物组织结构。
2、植物组织包埋切片技术是生物制片技术中最常用的一种技术。植物解剖学者主要用其观察细胞组织和器官的形态，制成永久装片保存。包埋切片技术最为常用的为石蜡切片包埋和树脂渗透包埋。
3、石蜡切片技术起始于18世纪，1869年为klebs所引用，是显微技术上最重要、最常用的方法之一。该方法是将材料包埋在石蜡中，然后连同石蜡在切片机上一同进行切片，所以称为石蜡切片法。最初的石蜡切片法，切片材料仅仅是为石蜡所包围，并非为石蜡所渗透。直到1882年出现石蜡包埋技术后，石蜡包埋法才被广泛地采用，在植物细胞、组织研究史上发挥了重要作用。
4、传统石蜡切片方法包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、展片、烤片、脱蜡、复水、染色、脱水、透明、封片。步骤较为繁琐，若中间有一步不慎出错都会影响染色效果以及制片效果；制片周期长，制片效率低。另外传统石蜡切片用二甲苯、丙酮等有机试剂较多，严重危害了制片者的身体健康。张俊佩等人介绍了一种木本植物非均质化组织石蜡切片制作方法，叔丁醇具有脱水和透明的双重作用，该方法采用叔丁醇梯度脱水法进行脱水，随后直接进行浸蜡，避免了采用二甲苯，同时还减少了操作步骤，该方法可以大幅缩短处理时间，提高工作效率。姜福建等人对植物组织石蜡切片包埋、修蜡过程进行改进，不仅提高了工作效率，而且
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种用于植物组织整体染色的方法，以解决作物幼嫩根系石蜡切片质量不佳，从而造成后续染色质量较差的问题。
2、基于上述目的，本专利技术提供了一种用于植物组织整体染色的方法，包括以下步骤：
3、(1)取材固定：取植物组织到固定液中进行固定，对固定液进行抽真空处理，固定时间为36-48h；
4、优选地，所述植物组织的大小为直径5-10mm，长度为10-20mm。
5、(2)冲洗：用50％的乙醇溶液对上述固定好的植物组织清洗2-3次，准备进行脱水处理；
6、(3)脱水：将清洗后的植物组织置于、50％乙醇溶液中保持2h、70％乙醇溶液中保持2h、80％乙醇溶液中保持1h、90％乙醇溶液中保持1h、无水乙醇中保持2h；
7、(4)浸蜡：将脱水植物组织依次采用油水比为3:7的改性石蜡乳液在58-65℃下处理5h，油水比为5:5的改性石蜡乳液在58-65℃下处理5h，油水比为7:3的改性石蜡乳液在58-65℃下处理5h；
8、(5)包埋：将浸蜡的植物组织于包埋机中进行包埋；
9、(6)切片、展片、烤片：使用石蜡切片机进行切片，切片漂浮在40℃的蒸馏水中进行展开，并在40℃下进行烤片；
10、(7)脱蜡、复水：将烤片后的植物组织依次采用油水比为7:3的改性石蜡乳液在65℃下处理20min，油水比为5:5的改性石蜡乳液在65℃下处理20min，油水比为3:7的改性石蜡乳液在65℃下处理20min，随后在无水乙醇中保持5s-在90％乙醇溶液中保持5s-在80％乙醇溶液中保持5s-在70％乙醇溶液中保持5s-在50％乙醇溶液中保持5s-在水中保持3s；
11、(8)染色：将复水后的植物组织切片放入番红染液后水洗-在50％乙醇溶液中保持3秒-在70％乙醇溶液中保持3秒-等乙醇溶液晾干后，切片入固绿染液，切片经过三次无水乙醇快速脱水，每次3s；随后用生物显微镜进行观察与拍照；
12、(9)封固：将上述切片放入二甲苯透明5分钟，使用加拿大树胶进行封片；封片后，将切片放于37℃温箱烘干，观察，拍照。
13、所述改性石蜡乳液的制备步骤如下：
14、s11：将纤维素分散在去离子水中，依次加入溴化钠，tempo，次氯酸钠溶液进行搅拌混合，反应体系的ph为10，反应时间为24-48h，洗涤，破碎得到cnf悬浮液，在-60℃下冷冻3-5d，得到固体cnf；
15、s12：将木质素分散在去离子水中，超声分散，随后加入浓度为75％的乙二胺水溶液和浓度为37％的甲醛水溶液，在80-90℃下搅拌3-5h，透析，干燥，得到胺化木质素；
16、s13：将胺化木质素与cnf分散在水相中，超声分散10分钟，得到混合悬浮；将石蜡装入离心管后放至65-75℃的恒温水浴锅中，当石蜡转变为液态时，将分散好的混合悬浮液倒入离心管，在高速均质机乳化，时间为2-5min，得到改性石蜡乳液。
17、优选地，所述为faa混合固定液，是由福尔马林、冰醋酸和70％乙醇按照重量比为5:5:90组成。
18、9.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述包埋为先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
19、优选地，所述切片的厚度为4μm。
20、优选地，所述s11中纤维素、去离子水、溴化钠、tempo、氯酸钠溶液的重量比为8-12:90-110:0.5-1.5:0.1-0.2:80-120。
21、优选地，所述s12中木质素、去离子水、浓度为75％的乙二胺水溶液、浓度为37％的甲醛水溶液的重量比为8-12:80-120:1-1.5:1.5-2.5。
22、优选地，所述s13中cnf与胺化木质素的重量比为1:1，占水相总质量的1％，水相与石蜡的重量比为3-7:7-3。
23、优选地，所述植物组织为作物的幼嫩根系组织。
24、本专利技术的有益效果：本专利技术的一种用于植物组织整体染色的方法，采用胺化木质素与cnf共同改性石蜡乳液，一方面增强了石蜡乳液的亲水性，有利于浸蜡，另一方面，对于作物幼嫩根系等软组织，胺化木质素与cnf形成的交联网络能够增强植物组织整体结构的稳定性，防止在浸蜡时组织因为较为软弱而破裂；相对于传统的植物组织石蜡切片降低了制作周期，并且木质素，纤维素等来源广泛，节约了成本。
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1.一种用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述为FAA混合固定液，是由福尔马林、冰醋酸和70％乙醇按照重量比为5:5:90组成。
3.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述包埋为先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
4.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述切片的厚度为4μm。
5.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述S11中纤维素、去离子水、溴化钠、TEMPO、氯酸钠溶液的重量比为8-12:90-110:0.5-1.5:0.1-0.2:80-120。
6.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述S12中木质素、去离子水、浓度为75％的乙二胺水溶液、浓度为37％的甲醛水溶液的重量比为8-12:80-120:1-1
7.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述S13中CNF与胺化木质素的重量比为1:1，占水相总质量的1％，水相与石蜡的重量比为3-7:7-3。
8.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述植物组织为作物的幼嫩芽组织。
...【技术特征摘要】
1.一种用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述为faa混合固定液，是由福尔马林、冰醋酸和70％乙醇按照重量比为5:5:90组成。
3.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述包埋为先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
4.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，所述切片的厚度为4μm。
5.根据权利要求1所述的用于植物组织整体染色的方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：关狄品，许留同，
申请(专利权)人：河南大科教学仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：
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