【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基于等温核酸扩增技术的快速扩增检测试剂盒，属于生物检测领域。
技术介绍
1、分子检测是以pcr技术为代表的检测，主要是通过检测病原体的dna或rna来鉴定病原体，准确率高，时间也相比传统检测要大大缩短，只需要数小时就可以得到结果，已经被越来越多的用在病原体的检测中。2019年爆发的非洲猪瘟，以及此次新型冠状病毒的检测，国家已经将核酸检测列入到了检测标准中去。预示分子检测将是今后的发展方向。
2、虽然pcr技术已经应用于分子生物学等各个领域，但是该技术需要通过不断的变化温度才能实现核酸扩增，因此，热循环仪是不可或缺的设备。然而，由于热循环仪体积大、价格较高，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。因此，陆续出现了不同的等温扩增技术，这些技术反应温度单一，不受热循环仪的制约，正逐渐成为pcr的最佳替代方法。
3、pcr的进程是由变性-退火-延伸三个基本反应步骤反复重复进行，一般变性温度在93-96℃，退火温度在50-55℃，延伸温度在60-75℃，扩增检测时间(60-120分钟)，对操作人员要求较高。
4、快速核酸检测平台的核心技术是等温核酸扩增技术，该技术可看作是生物体外的特殊dna复制。扩增过程主要使用了四种酶：重组酶、辅助蛋白、单链结合蛋白和dna聚合酶。整个扩增过程大体可分为三个过程，①重组酶和引物形成重组酶-引物复合体，在dna双链上找到和引物配对区域，解开双链dna；②解开的单链dna与单链结合蛋白结合，防止再度复性为双链dna；③在dna聚合酶的作用下，催化链的延伸
技术实现思路
1、本项目目标是建立起快速核酸检测平台并实现量产，为宠物猫冠状病毒和细小病毒的快速检测提供快速核酸检测试剂盒——rapid试剂盒。
2、本专利技术提供了检测猫冠状病毒和猫细小病毒的引物组，所述引物组包括(a)和(b)：
3、(a)核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的下游引物和核苷酸序列如seq id no.13所示的探针；
4、(b)核苷酸序列如seq id no.7所示的上游引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的下游引物和核苷酸序列如seq id no.14所示的探针。
5、在一种实施方式中，所述探针的序列的中间位置连接有荧光基团和淬灭基团，并且在3’端连接有c3spacer修饰。
6、在一种实施方式中，所述探针的序列为gttatagtgcaccatattattcttttgaagcg/dt-fam/dspacer/dt-bhq1/acacaagggccatta/c3 spacer和cgtgtaataggaggtacaagcaaccctat/dt-fam/dspacer/ca/dt-bhq1/attaggaagtttaga/c3 spacer。
7、本专利技术提供了所述引物组在制备检测猫冠状病毒和猫细小病毒的的试剂中的用途。
8、在一种实施方式中，所述试剂包括qpcr检测试剂盒、qpcr检测试剂盒或侧向层析试纸条。
9、本专利技术提供了一种检测猫冠状病毒和猫细小病毒的检测试剂盒，所述试剂盒含有所述引物组。
10、在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有醋酸镁、rpaid冻干粉和阳性对照质粒。
11、在一种实施方式中，所述阳性对照质粒为携带核苷酸序列如seq id no.15所示的片段的puc57质粒。
12、在一种实施方式中，用于检测猫冠状病毒和猫细小病毒时，反应体系如下：25μl的缓冲液，2μl的10μm上游引物，2μl的10μm下游引物，0.6μl的10μm探针，1μl的dna模板，16.7μl的ddh2o以及2.5μl的醋酸镁；
13、在一种实施方式中，反应在温度设定为37-40℃的荧光检测仪中进行，反应时间为10～40min，。
14、在一种实施方式中，荧光检测仪的通道设置为492～520nm。
15、本项目的等温核酸扩增技术具有以下的特点：
16、(1)等温扩增：在等温下进行扩增，使现场检测成为可能；
17、(2)检测快速：最快10分钟以内即可得到和pcr同样的效果，准确率不低于pcr的结果；
18、(3)灵敏度高：检测限可达到单拷贝，不低于pcr的灵敏度；
19、(4)设计简单：引物设计形式和pcr类似；
20、(5)检测方式多样：pcr可用的检测方式都可使用；
21、(6)无缝对接pcr：研究pcr技术的方法和手段，都可以使用。
22、有益效果：
23、本专利技术提供的产品最快10分钟以内即可得到与传统pcr相同的目的效果。不仅检测时间短、灵敏度高，并且摆脱了仪器的束缚，可以在非实验室环境下进行，达到现场检测的目的。另外，该方法操作方便，对人员要求不高，不仅适合于科研工作，还可以作为设备条件相对较差的基层单位相关人员来使用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.检测猫冠状病毒和猫细小病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括(A)和(B)：
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述探针的序列的中间位置连接有荧光基团和淬灭基团，并且在3’端连接有C3 Spacer修饰。
3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，所述探针的序列为Gttatagtgcaccatattattcttttgaagcg/dT-FAM/dSpacer/dT-BHQ1/acacaagggccatta/C3 Spacer和cgtgtaataggaggtacaagcaaccctat/dT-FAM/dSpacer/CA/dT-BHQ1/attaggaagtttaga/C3Spacer。
4.权利要求1～3任一所述引物组在制备检测猫冠状病毒和猫细小病毒的的试剂中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂包括qPCR检测试剂盒、qPCR检测试剂盒或侧向层析试纸条。
6.一种检测猫冠状病毒和猫细小病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1～3任一所述引物组。
7.根
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照质粒为携带核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的片段的pUC57质粒。
9.根据权利要求6～8任一所述的检测试剂盒，其特征在于，用于检测猫冠状病毒和猫细小病毒时，反应体系如下：25μL的缓冲液，2μL的10μM上游引物，2μL的10μM下游引物，0.6μL的10μM探针，1μL的DNA模板，16.7μL的ddH2O以及2.5μL的醋酸镁。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，反应在温度设定为37-40℃的荧光检测仪中进行，反应时间为10～40min。
...【技术特征摘要】
1.检测猫冠状病毒和猫细小病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括(a)和(b)：
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述探针的序列的中间位置连接有荧光基团和淬灭基团，并且在3’端连接有c3 spacer修饰。
3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，所述探针的序列为gttatagtgcaccatattattcttttgaagcg/dt-fam/dspacer/dt-bhq1/acacaagggccatta/c3 spacer和cgtgtaataggaggtacaagcaaccctat/dt-fam/dspacer/ca/dt-bhq1/attaggaagtttaga/c3spacer。
4.权利要求1～3任一所述引物组在制备检测猫冠状病毒和猫细小病毒的的试剂中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂包括qpcr检测试剂盒、qpcr检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦龙娟，景音娟，
申请(专利权)人：无锡纳思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。