【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体为一种crispr技术构建报告噬菌体的方法及其应用。
技术介绍
1、快速、灵敏、特异的致病菌检测分析对食品安全、 环境监测、 疾病诊断治疗和生物恐怖袭击的防范等具有重要意义。现有的致病菌检测方法包括如下：
2、传统的基于培养的检测方法，需经过增菌培养、分离纯化后，通过菌落特征、生化反应等完成病原菌的鉴定，但依靠各种生化反应的传统致病菌检测方法不仅操作复杂、检测周期长，且无法用于检测难培养的致病菌；随着分子生物学的迅速发展，基于病原体蛋白多肽特征指纹的蛋白质谱、核酸质谱、高通量测序、荧光定量pcr、胶体金等技术方法，极大缩短了病原微生物的鉴定时间；尽管鉴定的速度上得到了极大的提升，但上述诊断技术同样面临着一些挑战。例如不能鉴别区分死细菌和活细菌。分子生物学方法存在价格昂贵、标本质量要求高、干扰因素多等问题。
3、噬菌体具备极高的宿主专一性，且制备简单、价格低廉，且因其结构简单、易于基因工程的改造等优势，使得噬菌体检测技术，开始逐渐成为研究的热点；应用噬菌体检测病原菌，需要对噬菌体基因组进行改造，将外源检测信号的基因整合进噬菌体。传统的外源基因定点导入技术，是通过构建同源重组质粒，介导噬菌体基因组的同源区域与质粒的同源臂发生交换，从而实现目的片段与噬菌体基因组的整合，但重组效率较低（约为1/10000）；随着体外基因编辑技术的发展，酵母合成技术或体外分段式扩增技术，可在体外合成组装全长噬菌体基因组。但该方法电转效率较低，体外基因组编辑操作复杂。单用crispr技术进行基因编辑，也存在高
4、鉴于现有致病菌检测方法和噬菌体基因组改造方法的局限性，例如：传统检测方法，检测周期长，受限与标本质量、经济成本高；同源重组效率低，体外编辑工程量大，crispr编辑靶位点选择受限，缺乏正向标价，导致筛选效率低下等问，为此我们提出了一种crispr技术构建报告噬菌体的方法及其应用。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种crispr技术构建报告噬菌体的方法及其应用，专利技术了一种同源重组联合crispr系统介导的基因编辑技术，并成功构建了flag标记的t7::nluc报告噬菌体；解决了编辑工程效率低及检测受限的相关问题。
2、为实现上述所述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种crispr技术构建报告噬菌体的方法，包括以下步骤：
3、s1：基于6his与nanoluc基因的n端融合表达，设计flag、his、pelb修饰nanoluc表达框；
4、s2：制备t7噬菌体及菌株；
5、s3：采用gibson组装技术，构建同源重组质粒pfn-1000；
6、s4：基于pcas9质粒可表达cas9内切酶，与pcrispr-sg质粒表达的sgrna可实现双链dna的定点切割，进行crispr-cas9系统构建；
7、s5：进行sg靶序列的筛选；
8、s6：基于s3中同源重组质粒pfn-1000与s4中的crispr-cas9系统，进行pfn-1000/pcas9/pcrispr-sg三质粒菌株的构建；
9、s7：将野生型噬菌与三质粒菌株混合制备成双层平板，用枪头挑取pcr结果为双条带的噬菌斑，并用pfn-1000/pcas9/pcrispr-sg8宿主菌扩培，重组的噬菌体衣壳蛋白融合表达了flag标签，可通过flag抗体进行多轮筛选，完成elisa提纯重组噬菌体。
10、优选的，所述s1中设计flag、his、pelb修饰nanoluc表达框包括以下具体步骤：
11、s11：将pelb先导序列设计在nanoluc基因的上游，核糖体翻译的信号肽将会把将nanoluc荧光素酶引导至细胞的周质空间；
12、s12：之后将flag标签与10a基因的c端融合表达，flag的3’端加上taa终止密码，完成nanoluc表达框创建。
13、优选的，所述s2中制备t7噬菌体及菌株包括以下具体步骤：
14、s21：将bl21大肠杆菌干粉和t7噬菌体干粉，溶于lb培养基中；
15、s22：取200ulbl21大肠杆菌干粉过夜培养液与100ul t7溶液震荡混匀后静置15min，加入到55℃熔融的0.75%半固体培养基中，之后通过移液器吸打混匀后倒入无菌培养皿中；
16、s23：待无菌培养皿中软琼脂凝固后进行孵育，之后取15ml上层软琼脂到离心管中，用sm缓冲液清洗平板表面并加入离心管中离心10min，并用0.22um针头过滤器过滤去除细胞碎片，得到噬菌体裂解液；
17、s24：将s23中噬菌体裂解液进行10-9-10-20倍比稀释并取出100ul，与200ulbl21大肠杆菌溶液混匀加入到软琼脂中，制备成双层平板培养后，计算噬菌体效价。
18、优选的，所述s3采用gibson组装技术，构建同源重组质粒pfn-1000包括以下具体步骤：
19、s31：以噬菌体基因组为模板，用a001-1000/uhp-r引物扩增上游同源臂1000bp，同时用dhp-f/a006-1000引物扩增下游同源臂1000bp；
20、s32：以nanoluc基因为模板，利用pcr反应用引物fn-f/fn-r扩增nanoluc表达框，通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒，鉴定回收上述扩增的3个目的片段，且保证每个片段的首尾都有完全同源的20bp；
21、s33：以pce-zero质粒作为线性载体，在重组酶的作用下构建同源重组质粒pfn-1000，并转化dh5a感受态细胞，之后在amp平板上挑取三个单克隆菌落，用m13f/m13r引物进行菌落pcr验证。
22、优选的，所述s4中进行crispr-cas9系统构建包括以下具体步骤：
23、s41：首先，在靶向区域选择评分靠前的10个sg序列，并在sg序列上设计bsai酶切位点合成寡核酸链，通过t4连接酶，将sgran与bsai酶切的线性pcrispr质粒连接；
24、s42：构建pcrispr-sg（1-10）质粒菌株，将质粒分别在30ug/ml卡那霉素抗性平板上转化dh5a感受态，并进行培养后挑取单克隆菌落，用sg（1-10）-f/pcrispr-r引物，对10种pcrispr单克隆进行菌落pcr，并提取质粒dna送测序验证，将验证正确的菌株制备成pcrispr感受态；
25、s43：构建pcas9/pcrispr-sg(1-10)双质粒菌株，将pcas9质粒在50ug/ml氯霉素抗性平板上转化至s42中制备的pcrispr（1-10）感受态中，并进行培养后挑取单克隆菌落，用引物pcas9-f/pcas9-r进行菌落pcr验证，通过琼脂糖凝胶电泳验证目的条带大小，将本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述S1中设计Flag、His、PelB修饰Nanoluc表达框包括以下具体步骤：
3.根据权利要求1所述的一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述S2中制备T7噬菌体及菌株包括以下具体步骤：
4.根据权利要求2所述的一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述S3中采用Gibson组装技术，构建同源重组质粒PFN-1000包括以下具体步骤：
5.根据权利要求4所述的一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述S4中进行CRISPR-Cas9系统构建包括以下具体步骤：
6.根据权利要求5所述的一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述S41中将sg序列克隆到pCRISPR质粒的过程，需对合成的10对sg序列做退火磷酸化处理。
7.根据权利要求5所述的一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法，其特征在
8.根据权利要求7所述的一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述S6中PFN-1000/pCas9/pCRISPR-sg三质粒菌株的构建包括以下具体步骤：
9.根据权利要求8所述的一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述S7中完成ELISA提纯重组噬菌体包括以下具体步骤：
10.根据权利要求1-9任意一项所述的一种CRISPR技术构建报告噬菌体的应用，其特征在于：根据上述一种CRISPR技术构建报告噬菌体的方法在病原菌检测中的应用，对重组噬菌体进行灵敏度检测，且包括以下具体步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种crispr技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种crispr技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述s1中设计flag、his、pelb修饰nanoluc表达框包括以下具体步骤：
3.根据权利要求1所述的一种crispr技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述s2中制备t7噬菌体及菌株包括以下具体步骤：
4.根据权利要求2所述的一种crispr技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述s3中采用gibson组装技术，构建同源重组质粒pfn-1000包括以下具体步骤：
5.根据权利要求4所述的一种crispr技术构建报告噬菌体的方法，其特征在于：所述s4中进行crispr-cas9系统构建包括以下具体步骤：
6.根据权利要求5所述的一种crispr技术构建报告噬菌体的方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：王成彬，颜菁，李民伟，王驰，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第一医学中心，
类型：发明
国别省市：
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