【技术实现步骤摘要】
本申请涉及双特异性抗体细胞生物学活性检测，特别是涉及一种检测双特异性抗体细胞生物学活性的方法。
技术介绍
1、本申请的双特异性抗体是指包含a和b双靶点的抗体，其中，a靶点是一种t细胞共刺激免疫检查点分子，是免疫反应的重要调节剂；b靶点是一种细胞表面糖蛋白，其在多种肿瘤中过表达。该双特异性抗体识别肿瘤细胞，活化t细胞，激活adcc和adcp介导的对肿瘤细胞的清除作用。
2、抗体药物的活性测定是对药物的有效性和药物效价的测定，是抗体药物评价体系中必不可少的部分，是探索药物作用机制(moa)，提供药物ind申报依据的重要手段。
3、但是，目前尚未有特别针对以上a和b双靶点的双特异性抗体的细胞生物学活性检测方法。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种新的检测双特异性抗体细胞生物学活性的方法。
2、为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
3、本申请公开了一种检测双特异性抗体细胞生物学活性的方法，包括以下步骤：
4、靶细胞铺板步骤，包括将靶细胞加入细胞培养板的微孔中，放入二氧化碳培养箱静置培养；
5、效应细胞铺板步骤，包括在靶细胞铺板培养后，将效应细胞加入相同的微孔中，离心，弃上清，备用；
6、待测样品检测步骤，包括将待测双特异性抗体加入含有靶细胞和效应细胞的微孔中，放入二氧化碳培养箱静置培养，培养完成后，拿出细胞培养板室温静置，避光加入bright-lite检测试剂，使用酶标仪检测发光值，根据发光值
7、需要说明的是，本申请的双特异性抗体细胞生物学活性检测方法，当待测双特异性抗体加入靶细胞和效应细胞后，重新建立活化的t细胞核内因子(nuclear factorofactivated t-cells,nfat)途径，因此，加入混合后的bright-lite检测试剂使细胞裂解，释放出荧光素酶，激活发光，即可采用酶标仪检测发光值；并且，根据发光值大小即可初步判断双特异性抗体细胞生物学活性。
8、本申请的一种实现方式中，靶细胞为h226细胞。
9、本申请的一种实现方式中，靶细胞铺板步骤每孔加入3000cells靶细胞，加入的靶细胞悬浮液的体积为50μl。
10、本申请的一种实现方式中，靶细胞铺板步骤二氧化碳培养箱静置培养的时间为16-20h。
11、本申请的一种实现方式中，效应细胞为hek-293/nfκb-luci/hu4-1bb细胞，即稳定表达人4-1bb膜蛋白以及nfκb-luciferase报告基因的hek293细胞。
12、本申请的一种实现方式中，效应细胞铺板步骤中，每孔加入6000cells效应细胞，加入的效应细胞悬浮液的体积为50μl。
13、本申请的一种实现方式中，根据发光值分析待测双特异性抗体的细胞生物学活性，具体包括，根据待测双特异性抗体获得的发光值，与已知样本获得的量效曲线进行比较，从而分析待测双特异性抗体的细胞生物学活性。
14、本申请的一种实现方式中，量效曲线的制备方法包括，由浓度为10000ng/ml的已知双特异性抗体经过3倍梯度稀释获得的总计11个梯度标准品，测量其发光值，使用四参数拟合回归模型绘制曲线，即获得所述量效曲线。
15、本申请的一种实现方式中，量效曲线分析待测双特异性抗体的细胞生物学活性，具体包括，计算标准品和待测双特异性抗体的ec50，通过比较标准品和待测双特异性抗体的半数有效浓度ec50，计算待测双特异性抗体的相对细胞生物学活性。
16、本申请的一种实现方式中，使用四参数拟合回归模型绘制曲线，具体采用graphpad prism 8.0软件完成。
17、需要说明的是，量效曲线可以对待测双特异性抗体的细胞生物学活性进行相对定量，从而方便进一步的评估和比较待测双特异性抗体的细胞生物学活性。
18、由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
19、本申请检测双特异性抗体细胞生物学活性的方法，利用双特异性抗体重新建立活化的t细胞核内因子途径的特点，采用bright-lite检测试剂，释放出荧光素酶，激活发光，根据发光值分析双特异性抗体细胞生物学活性。本申请为双特异性抗体细胞生物学活性检测提供了一种简单、易操作，且相对准确的分析方法。
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1.一种检测双特异性抗体细胞生物学活性的方法，其特征在于：包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述靶细胞为H226细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶细胞铺板步骤中，每孔加入3000cells靶细胞，加入的靶细胞悬浮液的体积为50μL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶细胞铺板步骤中，二氧化碳培养箱静置培养的时间为16-20h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述效应细胞为HEK-293/NFκB-Luci/Hu4-1BB细胞，即稳定表达人4-1BB膜蛋白以及NFκB-Luciferase报告基因的HEK293细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述效应细胞铺板步骤中，每孔加入6000cells效应细胞，加入的效应细胞悬浮液的体积为50μL。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述根据发光值分析待测双特异性抗体的细胞生物学活性，具体包括，根据待测双特异性抗体获得的发光值，与已知样本获得的量效曲线进行比较，从而
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述量效曲线的制备方法包括，由浓度为10000ng/mL的已知双特异性抗体经过3倍梯度稀释获得的总计11个梯度标准品，测量其发光值，使用四参数拟合回归模型绘制曲线，即获得所述量效曲线。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：根据量效曲线分析待测双特异性抗体的细胞生物学活性，具体包括，计算标准品和待测双特异性抗体的EC50，通过比较标准品和待测双特异性抗体的半数有效浓度EC50，计算待测双特异性抗体的相对细胞生物学活性。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述使用四参数拟合回归模型绘制曲线，具体采用GraphPad Prism 8.0软件完成。
...【技术特征摘要】
1.一种检测双特异性抗体细胞生物学活性的方法，其特征在于：包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述靶细胞为h226细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶细胞铺板步骤中，每孔加入3000cells靶细胞，加入的靶细胞悬浮液的体积为50μl。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶细胞铺板步骤中，二氧化碳培养箱静置培养的时间为16-20h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述效应细胞为hek-293/nfκb-luci/hu4-1bb细胞，即稳定表达人4-1bb膜蛋白以及nfκb-luciferase报告基因的hek293细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述效应细胞铺板步骤中，每孔加入6000cells效应细胞，加入的效应细胞悬浮液的体积为50μl。
7.根据权利要求1-6任一项所...
【专利技术属性】
技术研发人员：靳翠翠，彭嘉毅，谢秋莹，许滨盛，
申请(专利权)人：深圳市乐土生命科技投资有限公司，
类型：发明
国别省市：
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